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1、临床医学论文-三氧化二砷诱导肝癌细胞系 HepG-2 自噬及其机制研究作者：朱传升侯明王金慎王焱徐文伟董琳 【摘要】 目的：测定不同浓度三氧化二砷（As2O3）诱导前后 HepG-2 细胞自噬水平改变，并初步探讨机制。方法：常规细胞培养，按 As2O3 不同浓度分组；采用 MDC 染色，荧光显微镜观察自噬囊泡，流式细胞术检测其荧光强度；RT-PCR 检测 Bcl-2 基因转录，免疫组织化学检测细胞 Bcl-2 蛋白阳性百分率，并分析同自噬的关系。结果：经不同浓度 As2O3 作用后，HepG-2 细胞生长明显受到抑制；荧光显微镜可观察到自噬囊泡的出现；Bcl-2 基因表达降低；经相关性分析，H
2、L-60 细胞自噬水平与 Bcl-2 基因表达呈负相关。结论：As2O3 可诱导 HepG-2 细胞自噬，v 诱导 HepG-2 细胞自噬的机制可能与下调 Bcl-2 基因表达有关，自噬和凋亡存在交叉。 【关键词】 自噬基因，Bcl-2三氧化二砷肝肿瘤细胞 培养的Study of HepG-2 cells autophagy induced by arsenic trioxide and its mechanism【ABSTRACT】 Objective: To assess the level of autophagy and its mechanism in HepG-2 cells af
3、ter induction with arsenic trioxide. Methods: The autophagy was analyzed using fluorescent microscope and flow cytometry by monodansylcadaverin（MDC） staining. RT-PCR was used to examine the Bcl-2 mRNA expression. APAAP was used to detect Bcl-2 protein positive percentage and its correlation with aut
4、ophagy level was analyzed. Results: HL-60 cells growth was obviously inhibited after induction with different density arsenic trioxide; autophagy vesica was observed using fluorescent microscope; Bcl-2 gene expression was inhibited; cells autophagy level was negative correlated with Bcl-2 gene expre
5、ssion. Conclusion: Arsenic trioxide may induce HpG-2 cells to autophagia and its main mechanism was to down-regulate bcl-2 gene expression. 【KEY WORDS】 Autophagy Gene，Bcl-2Arsenic trioxideLiver neoplasmsCells, cultured三氧化二砷（As2O3）作为一种抗肿瘤药物，主要机制是诱导肿瘤细胞凋亡。关于 As2O3 是否可诱导肿瘤细胞发生非凋亡形式的死亡（如自噬等），国内外报道较少。本研究
6、通过观察不同浓度 As2O3 作用 HepG-2 细胞前后自噬水平的变化，初步探讨了其发生机制，总结报道如下。1材料与方法1.1主要试剂单丹磺酰尸胺（MDC，货号 30432）为美国 sigma 公司产品，临用前用 PBS 配制成 0.05 mmol/L；As2O3 1 g/L（哈尔滨伊达药业产品），用前 RPMI 1640 稀释成所需浓度；RT-PCR 所用 TapDNA 聚合酶、dNTPs、RNA 酶抑制剂等购自上海志壮生物有限公司；目的引物参照文献说明，由上海生工合成。免疫组化试剂盒、鼠抗人 Bcl-2 单抗、羊抗小鼠 lgG 二抗均购自北京中杉金桥生物有限公司。1.2细胞培养及分组肝癌
7、细胞株 HepG-2 由山东省千佛山医院普外科中心实验室传代培养。实验细胞以 2105 ml-1 接种于培养瓶中，培养液为 10%胎牛血清的 RPMI 1640，置 37 、饱和湿度、5%CO2 培养箱，行细胞爬片生长。待细胞贴壁后，分别加入不同浓度 As2O3 处理。按 As2O3 浓度不同分为 0 （对照组）、1.0、 2.0、 4.0 和 8.0 mol/L 5 组；各组于处理 24 h 后用 0.25% 胰蛋白酶消化，收获细胞或取出细胞爬片，进行观察研究。1.3一般形态观察分别于加药前后倒置显微镜观察，并摄片。1. 4MDC 荧光染色检测自噬 自噬泡（autophagicvacuole
8、s，AV）的染色：参考文献1，取出细胞爬片，PBS 洗 2 次，除去含血清的培养基。用 0.05 mmolL MDC 于 37 温育 60 min 后，4%多聚甲醛固定 15 min，PBS 洗 2次，晾干后，使用荧光显微镜（Olympus）加 356 nm 发射滤片和 545 nm 断滤片进行观察和摄片。 1.5自噬的流式细胞术定量分析以上述 MDC 染色方法染色，用 Elite 流式细胞仪（COULTER 公司，USA）以 488 nm 激发波长，测定 MDC 染色的荧光强度。将光散射及荧光数据输入计算机分析得出结果。1.6RT-PCR 检测 Bcl-2 mRNA 表达37 、饱和湿度、5
9、%CO2 培养箱培养 24 h 后，收集细胞，PBS 洗2 次。采用异硫氰酸胍一步法提取 RNA，260/280 nm 测定其浓度和纯度；RT-PCR 步骤参照逆转录酶试剂盒说明。Bcl-2 引物序列: Sense 5TGTGGCCTTCTTTGAGTTCG3， Antisense 5TCACTTGTGGCTCAGATAGG3，片段 280 bp；action 引物序列：Sense 5GGGTCAGAAGGATTCCTGTG3，Antisense 5GGTCTCAAACATGATCTGGG3，片段 317 bp。PCR 产物各 20 l,在 10 g/L琼脂糖凝胶中电泳分离，溴化乙锭染色,并在
10、紫外灯下显影拍照。1.7免疫组化法检测细胞 Bcl-2 蛋白阳性率采用 APAAP 法，具体染色步骤参照试剂盒说明。阳性结果为胞质内出现红色颗粒，油镜下计数 100 个细胞，并计算阳性细胞百分率。每组实验重复 3 次，以 3 次结果的均值为最后结果。1.8统计学处理采用 SPSS10.0 软件包进行统计学分析。数据以 xs 表示；两样本均数之间的比较，采用 t 检验。相关性分析采用 Pearson 直线相关分析。=0.05 为显着性检验标准。2结果2.1As2O3 对 HepG-2 细胞生长的影响倒置显微镜观察对照组细胞数目较多，细胞伸展良好，胞质均匀透明。经 As2O3 作用 24 h 后，
11、与对照组比较，各组细胞数目明显减少，部分细胞贴壁能力下降，呈飘浮生长状态，细胞形态逐渐变圆，体积变小（图 1）。 2.2HepG-2 细胞自噬水平改变MDC 可被 HepG2 细胞吸收并选择性地聚集于自噬囊泡中，荧光显微镜观察时染上 MDC 荧光的 AV 呈深绿色或黄绿色点状结构，多散布于核周。对照组细胞，仅见到很少量的 MDC 阳性细胞，并且每个细胞中含的 AV 数量很少；而在各 As2O3 处理组，MDC 阳性细胞数明显增加，每个细胞中 AV 数量也较多（图 2）。流式细胞术定量测定 MDC 阳性细胞百分率随As2O3 浓度增加而递增，与对照组比较，差异有统计学意义，P0.05（表 1，图
12、 3）。2.3As2O3 对 Bcl-2 基因转录水平及 Bcl-2 蛋白表达影响经不同浓度As2O3 作用 24 h 后，各组 Bcl-2 基因表达较对照组均明显减弱，且与 As2O3 浓度有关（图 4）。对照组及各处理组均可检测到 Bcl-2 蛋白表达，阳性结果为胞质内出现红色颗粒（图 5）。各处理组平均 Bcl-2 蛋白阳性细胞数随 As2O3浓度上升而下降,与对照组比较，差异有统计学意义，P0.05，见表 1。2.4细胞自噬同 Bcl-2 基因表达的关系经相关性分析，细胞自噬水平与Bcl-2 蛋白阳性细胞数呈负相关（r=-0.47, P0.05）。讨论几十年以来，凋亡一直作为细胞程序性
13、死亡的主要和唯一机制。证据表明，化疗不仅可引起肿瘤细胞凋亡，还可引起其它形式的非凋亡形式死亡如坏死、自噬、有丝分裂突变以及细胞衰老等2。Clarke3将细胞死亡分为：（1）凋亡性程序性细胞死亡；（2）自噬性程序性细胞死亡；（3）非溶酶体降解；（4）细胞质型降解。自噬作为细胞死亡的一种新的形式，越来越引起人们的重视。砷剂是我国首先发现的抗白血病药物，世纪 70 年代开始应用于临床，近年来用于治疗多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征和各种实体瘤。但其抗肿瘤机制尚不清楚，大多数观点认为与其诱导凋亡有关。关于 As2O3 是否可诱导细胞自噬，国内外报道较少。单丹磺酰尸胺（MDC）是一种特殊染料，可被细胞吸
14、收并与自噬囊胞特异结合，可在荧光显微镜下呈现绿色或黄绿色荧光，是一种定量检查自噬的特异性方法。本研究利用 MDC 这种染料，参照文献1方法，发现经 As2O3 作用后，HepG-2 细胞生长明显受到抑制，而自噬水平显着升高，有浓度依赖性。这与国外报道相似，如 Kanzawa 等4观察到小剂量As2O3（2 mol/L）可显着抑制 6 种胶质瘤细胞系的增殖，使胶质瘤细胞停止在 G2/M 期，呈浓度依赖性；电镜观察到自噬，而不是凋亡。半胱天冬酶抑制剂不能抑制 As2O3 诱导的细胞死亡。Bcl-2 是一种凋亡抑制基因，通常认为它主要抑制线粒体通透蛋白（permeability transition
15、 protein，PTP）开放并维持线粒体膜电位，抑制细胞色素 C 和酸性同功铁蛋白（acidic isoferritin，AIF）从线粒体释放入胞质，从而抑制凋亡5，6。本研究用 RT-PCR 和免疫组织化学分别在基因转录水平和蛋白水平检测了 Bcl-2 表达，发现经 As2O3 作用后，Bcl-2 表达明显下调，且与 HepG-2 自噬水平呈负相关，提示 Bcl-2 的表达调控可能与细胞自噬存在一定的关系。SaekiK 等7用 Bcl-2 基因全长的反义 mRNA 寡核苷酸序列株转染HL-60 细胞后，细胞生长明显受到抑制，并且出现了大量的细胞死亡，电镜显示细胞死于自噬，细胞形态和线粒体并
16、无明显变化。既无线粒体膜电位的下降，也无 AIF 的核转录。半胱天冬酶抑制剂不能阻断 Bcl-2 mRNA 下调诱导的自噬。Pattingre 等8研究发现，Bcl-2 与目前证实的自噬调控基因 Beclin 1 作用相反，认为 Bcl-2 作为一种致癌基因可能同时抑制了自噬和凋亡。Shimizu 9等认为 Bcl-2 家族蛋白不仅调控凋亡，而且可以调节自噬基因依赖的非凋亡形式的其它类型的程序性细胞死亡。总之，As2O3 诱导 HepG-2 细胞发生非凋亡性细胞死亡自噬，可能成为一种新的抗肿瘤途径。As2O3 诱导 HepG-2 细胞自噬的机制可能与下调凋亡抑制基因 Bcl-2 表达有关，自噬和凋亡可能在某些环节存在交叉。【参考文献】1 Biederbick A, kern HF, Elsasser HP. Monodansy
