《三七总皂苷部分逆转黏附诱导的骨髓瘤细胞耐药性【医学论文】》由会员分享，可在线阅读，更多相关《三七总皂苷部分逆转黏附诱导的骨髓瘤细胞耐药性【医学论文】（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、医学论文-三七总皂苷部分逆转黏附诱导的骨髓瘤细胞耐药性【摘要】 目的： 研究三七总皂苷（PNS）对骨髓瘤细胞 RPMI8226 黏附及黏附诱导耐药的影响. 方法： 采用 MTT 法检测 PNS 和/或阿霉素（Adr）对RPMI8226 细胞的毒性作用；荧光染料二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记并流式细胞术检测 RPMI8226 细胞与纤连蛋白（FN）黏附率. 结果： RPMI8226 细胞与 FN 黏附 2，12 h，其黏附率分别为(55.631.56)%，(65.422.46)%；经亚细胞毒浓度 PNS（50 mg/L）预处理后，其黏附率分别降为(33.241.29)%,(34.161.5
2、9)%，处理前后差异有统计学意义（P0.05). 结论： PNS 可降低 RPMI8226 细胞与 FN 的黏附率，并能部分逆转黏附介导的骨髓瘤耐药. 【关键词】 三七总皂苷 多发性骨髓瘤 RPMI8226 黏附 抗药性0 引言多发性骨髓瘤（multiple myeloma, MM）是一种难以治愈的浆细胞恶性肿瘤，难治性的生物学基础是瘤细胞与细胞外基质（ECM）相互黏附介导的多药耐药形成（cell adhesion mediated drug resistance，CAMDR ）. MM 细胞与ECM 间相互黏附主要通过细胞表面的整合素（integrin）与其配体纤连蛋白（fibronecti
3、n, FN）结合. 体外实验证实，采用封闭性抗体阻断整合素与 FN间的相互作用，瘤细胞与 FN 间的黏附性明显下降，其 CAMDR 也得以完全或部分逆转1. 所以寻找高效低毒药物以下调 MM 细胞的黏附性，从而增加瘤细胞对化疗的敏感性具有重要意义. 中药三七总皂苷（panax notoginoside，PNS）能抑制血小板的黏附与聚集，进而发挥其活血化瘀功效2. 鉴于血小板的黏附、聚集与 MM 细胞的黏附有着类似的生物学过程，因此，PNS 能否下调骨髓瘤细胞黏附性从而逆转黏附介导的肿瘤耐药值得进一步研究. 为此，我们以人 MM 细胞株 RPMI8226 细胞为材料，初步探讨 PNS 对 MM
4、细胞黏附性及 CAMDR 的影响.1 材料和方法1.1 材料血塞通注射液源自昆明制药集团股份有限公司（每支含生药 250 mg，主要成份为人参皂苷 Rb1，人参皂苷 Rg1，三七皂苷 R1），-20分装冻存；注射用盐酸阿霉素（adriamycin，Adr）源自山西普德药业有限公司；小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司. 四氮唑蓝（MTT），羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯5(6)carboxyfluorescein diacetate Nsuccinimidyl ester，CFSE为 Sigma 产品；纤连蛋白（FN）为 Becton Dickinson 产品，注射用水溶解分装，-20冻
5、存.1.2 方法1.2.1 细胞培养人多发性骨髓瘤细胞系 RPMI8226 细胞来源于苏州大学免疫学教研室. 细胞培养于含 100 mL/L 热灭活胎牛血清的 RPMI1640 培养液中，置于 50 mL/L CO2，饱和湿度、37培养箱中悬浮培养，实验用细胞处于对数生长期.1.2.2MTT 实验取对数生长期 RPMI8226 细胞按 2.0104/孔种入 96 孔板，根据预实验设 PNS 浓度为 50，75，100，200，300，400，600，800 mg/L，在相同实验条件下，处理组中细胞分别加入不同浓度的 PNS，每个浓度设 3 个平行孔，于加药后 24 h 检测，检测前每孔加入 M
6、TT 溶液（5 g/L） 10 L，37孵育 4 h 后，加入 100 L 100 g/L SDS（含 0.01 mol/L HCl），充分溶解结晶物3，570 nm 波长测定各孔 A 值，实验重复 3 次，取平均值，计算生长抑制率（1-试验组 A 值/对照组 A 值)100.1.2.3 黏附实验用无菌过滤的 TSM(20 mmol/L TrisHCl ，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L CaCl2，2 mmol/L MgCl2，pH8.0)配制 50 mg/L 的 FN 及 10 g/L BSA4，每孔 50 L 分别包被 96 孔板，4过夜. 取对数生长期RPMI8226
7、细胞（1.0109/L），37，50 mL/L CO2 条件下以 2.5 mg/L CFSE标记 30 min，加无血清 RPMI1640 液孵育 12 h. CFSE 标记细胞经非抑制浓度PNS（50 mg/L）预孵育 2 h 后，按细胞/2.0104 孔，种入 96 孔板. 实验分 4组： FN 包被组； BSA 包被组； PNS+FN 组； PNS+BSA 组. 各组细胞分别 37，50 mL/L CO2 中培养 2 h 与 12 h. 收集上清（含未黏附细胞），经流式细胞仪检测 CFSE 阳性细胞数. 细胞黏附率(%) =（1-上清液细胞数/总细胞数）100%5.1.2.4PNS 对
8、RPMI8226 细胞 CAMDR 的影响 FN 与 BSA 包被处理同前. 对数生长期 RPMI8226 细胞经非抑制浓度 PNS（50 mg/L）预孵育 2 h 后，按细胞2.0104/孔，种入 96 孔板，黏附 12 h，每孔分别加入不同浓度Adr（0.25，0.5，0.75 mol/L），作用 1 h，离心弃上清，加完全 RPMI1640液培养 24 h. 按 MTT 法测定生长抑制率()6. 实验分 4 组: FN+Adr 组； BSA+Adr 组； PNS+Adr+FN 组； PNS+Adr+BSA 组.统计学处理:用 SPSS11.0 软件进行处理，实验结果以 xs 表示，组间均
9、数比较用方差分析，两两比较采用 LSDt 检验. 2 结果2.1PNS 对 RPMI8226 细胞增殖的影响 PNS 对 RPMI8226 细胞的增殖抑制作用呈浓度依赖性，其 24 h IC50 值为(216.522.31) mg/L（图 1）.图 1 不同浓度 PNS 对 RPMI8226 细胞增殖的影响2.2PNS 对 RPMI8226 细胞黏附的抑制作用 RPMI8226 细胞黏附 2 h，FN 组黏附率(55.631.56)%高于 PNS+FN 组(33.241.29)%（P0.05），其余实验组 12 h 黏附率无统计学变化.2.3PNS 逆转 RPMI8226 细胞 CAMDR 经
10、 Adr 作用 24 h 后，BSA 对照组呈浓度依赖性凋亡，其 IC50 为（2.030.13） mol/L；MM 细胞与 FN 黏附后可以挽救 Adr 诱导的细胞凋亡，其 IC50 （2.700.24） mol/L，高于 BSA 对照组(P0.05），说明 PNS 能部分逆黏附介导的 MM 细胞耐药性.3 讨论CAMDR 是多发性骨髓瘤难以治愈的主要生物学机制之一7. 筛选高效抑制瘤细胞黏附并且能逆转其 CAMDR 的药物，已成为骨髓瘤治疗领域的研究热点. PNS 可以抑制 ADP,花生四稀酸、血小板活化因子、凝血酶、胶原等诱导的血小板聚集；也可抑制内毒素诱导的粒细胞黏附分子的表达，进而降
11、低白细胞与细静脉内皮之间的黏附性. PNS 的抗细胞黏附、抗血小板聚集作用极可能为其化“瘀”功效的生物学机制之一. 鉴于 MM 细胞与胞外基质成分（如纤连蛋白等）之间的相互黏附也可部分理解为中医学的“瘀”症，故利用 PNS 的化“瘀”功效下调 MM 细胞的黏附性,以部分逆转黏附介导的 MM 耐药性就具有潜在的研究价值. 本实验证实,非抑制浓度 PNS 可显着抑制 RPMI8226 细胞对基质成分 FN 的黏附性，进而降低 FN 黏附组 MM 细胞对阿霉素的 IC50 值. 表明 PNS 能部分逆转 MM 细胞的 CAMDR ，其效应机制可能与下调 MM 细胞与 FN 间的黏附性有关.【参考文献
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