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1、专题2,微生物的培养与应用,课题2,涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？,问题讨论,涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？,应从操作的各个细节保证“无菌”。 例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。,问题讨论,微生物的恒温培养,微生物的恒温培养,微生物的恒温培养,菌种的保存,1.临时保藏： 接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4冰箱保存。 2.长期保存： 甘油冷冻管藏法,四、课题成果评价,（一）培养基
2、的制作是否合格 如果未接种的培养基在恒温箱中保温12 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。,（二）接种操作是否符合无菌要求 如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。,（三）是否进行了及时细致的观察与记录 培养12 h与24 h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。这一步的要求主要是培养学生良好的科学态度与习惯。,尿素CO(NH2)2重要的农业氮肥。 只能被土
3、壤中细菌分解为NH3才能被植物吸收利用 CO(NH2)2 + H2O CO2 +2NH3,分离产生脲酶的细菌,一、课题背景,两个主要目的： (1)从土壤中分离出能够分解尿素的细菌； (2)统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。,二、研究思路,提出的问题 如何寻找耐高温的酶？ 解决问题的思路 寻找耐高温环境； 原理 高温淘汰其他菌，选出耐高温细菌， 耐高温菌种提取耐高温酶。,水生耐热细菌Taq ( Thermus aquaticus ) 耐高温的Taq DNA聚合酶 美国微生物学科布鲁克（T.Brock) 1966年发现耐热细菌,研究思路,（一）筛选菌株,要分离一种微生物，必须根据该微生物的
4、特点，包括营养、生理、生长条件等； 方法： 抑制大多数微生物的生长 促进目的菌株的生长 结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。,实验室中微生物的筛选原理：,人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。,尿素分子的立体结构,CO(NH2)2+H2O CO2+2NH3,脲 酶,分解尿素的细菌:,（一）筛选菌株 KH2PO4 1.4g NaHPO4 2.1g MgSO4 H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 琼脂 15.0g 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL。,该培养基的配方中，为微生物
5、的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？ 此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？,?,碳源：葡萄糖、尿素,氮源：尿素,能。只有产生脲酶的 细菌能利用尿素作为氮源而生存。,在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。,选择培养基,背景知识,测定微生物数量的方法：,1直接计数法： 最常用显微镜直接计数法。,测定微生物数量的方法：,背景知识,1、显微镜直接计数：,利用血球计数板(血细胞计数板），在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,.统计菌落数目：,不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；
6、,缺点：,优点： 设备简单、能观察微生物的形态特征。,2间接计数法： 最常用稀释平板计数法。,（二）统计菌落数目,（二）统计菌落数目,统计菌落数目的理论依据： 当样品的稀释度足够高 时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键。为了保证结果准确，通常将几个稀释度下的菌液都涂布在平板上，培养后再选择菌落数在30300的平板进行计数。,每克样品中的菌株数 = (CV)M,C：某一稀释度下平板上生长的平均 菌落数 V：涂布平板时所用的稀释液的体积 (ml) M：稀释倍数,1.某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234
7、，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml）( ) A. 2.34108 B. 2.34109 C. 234 D. 23.4,练一练,统计的菌落往往 比活菌的实际数目低。 这是因为当两个或多 个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。,注意：,两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。 1.第一位同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。 2.第二位同学在该浓度下涂布了三个平板，统计的菌落数分别为21、212和256，该同学以这三个平板菌落数的平均值1
8、63作为统计结果。,实例1,你认为哪位同学的结果更接近真实值？这两位同学的实验需要改进吗？如果需要，如何改进？,?,你认为哪位同学的结果更接近真实值？这两位同学的实验需要改进吗？如果需要，如何改进？,第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。,?,因此，这两位同学的实验需要改进，在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复
9、组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。,说明设置重复组的重要性。,注意事项 为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板上进行计数。 为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平板中，经涂布，培养计算出菌落平均数。 统计的菌落往往比活菌的实际数目低。,在做本课题的实验时，A同学从对应106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落。但是，其它同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。 其他同学认为A同学的结果有问题。他们分析可能是A同学的培养基被杂菌污染了，或者培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基上生长。,但是，A同学确信自己
10、的实验操作准确无误，与其他同学的结果之所以不相同，是因为自己所选用的土壤样品不同。,但是，A同学确信自己的实验操作准确无误，与其他同学的结果之所以不相同，是因为自己所选用的土壤样品不同。但是，A同学在设计实验的时候并没有设置对照，因而此时也拿不出令同学们信服的证据。 你能通过设置对照，帮助A同学排除上述两个可能影响实验结果的因素吗？,一是由于土样不同，二是由于培养基污染或操作失误。究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。,一是由于土样不同，二是由于培养基污染或操作失误。究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。 一种方案：可以由其他同学用与A同学一样的土样进行实验, 如果结果与A同学一致，则证明A无误;
11、 如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。,另一种方案： 将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。 通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。,（三）设置对照 1、设置对照的目的： 排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。 对照实验是指除了 被测试 的条件外，其他条件都 相同 的实验。满足该条件的称为 对照组，未满足该条件的称为 实验 组。,（三）设置对照,判断培养基中是否有杂菌污染：,将未接种的培养基同时进行培养。,判断选择培养基是否具有筛选作用：,完全培养基（营养成分齐全）接种
12、后培养 观察菌落数目。,主要目的是排除实验组中非测试因素对实验 结果的影响，提高实验结果的可信度。,实验设计,土壤中分解尿素的细菌的分离与记数,土壤中某样品细菌的分离与计数,从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。,实验步骤,1土壤取样,实验设计,从肥沃、酸碱度接近中性的湿润土壤中取样。先铲去表层土3 cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。,“微生物的天然培养基”,一土壤取样,数量最大、种类最多,大约70%90%是细菌,取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。,制备5个牛肉膏蛋白胨培养基和15个选择培养基。,实验步骤,2.制备
13、培养基,怎样证明此培养基具有选择性呢？,以尿素为 唯一氮源 的培养基,牛肉膏 蛋白胨 培养基,是,分离 尿素 细菌,判断该 培养基 有无选 择性,只生长尿素细菌,生长多种微生物,是,制备5个牛肉膏蛋白胨培养基和15个选择培养基。 注：每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基。 稀释倍数为103107。,实验步骤,2.制备培养基,为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？,因为土壤中各类微生物的数量(单位：株/kg)是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线菌数约为
14、477万，霉菌数约为23.1万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。,测定土壤中细菌的数量，一般选用104、105和106倍的稀释液进行平板培养；测定放线菌的数量，一般选用103、104和105倍稀释；测定真菌的数量，一般选用102、103和104倍稀释。,注： 样品的稀释,将10g土样加入盛有90mL无菌生理盐水的锥形瓶中,充分摇匀，吸取上清液1mL，转移至盛有9mL水的无菌试管中，依次等比稀释至107稀释度，并按照由107至103稀释度的顺序分别吸取0.1mL进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。,
15、实验步骤,3.微生物的培养与观察,将涂布好的培养皿放在30下培养。比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。 挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红培养基的斜面中，观察能否变红。,不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在3037的温度下培养12d；放线菌一般在2528的温度下培养57d；而霉菌一般在2528的温度下培养34d。,注：,一般来说，在一定的培养条件下(相同的培养基、温度及培养时间)，同种微生物表现出稳定的菌落特征。,EMB培养基与大肠杆菌代谢产物产生紫色带金属光边的菌落,当菌落数目稳定时，选取菌落数在30300的平板进行计数。在同一稀释度
16、下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。,实验步骤,4.细菌的计数,每克土壤样品菌数 = 某稀释倍数的菌落平均数稀释倍数细菌培养时所用的稀释液体积,一无菌操作 1.取土用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都需要灭菌。 2.应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。 3.在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。,操作提示,二做好标记 注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。 三规划时间,四.结果分析与评价 1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。 2.提示：选择每个平板上长有30300个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落
