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1、第 二 十 章,高 效 液 相 色 谱 法,高效液相色谱法的特点 一、概述 液相色谱法是指流动相为液体的技术。 早期的液相色谱（经典液相色谱）是将小体 积的试液注入色谱柱上部，然后用洗脱液 （流动相）洗脱。这种经典色谱法，流动相 依靠自身的重力穿过色谱柱，柱效差(固定相 颗粒不能太小)，分离时间很长。,70年代初期发展起来的高效液相色谱法，克服 了经典液相色谱法柱效低，分离时间很长的缺点。成 为一种高效、快速的分离技术。高效液相色谱法是在 经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技 术上，流动相改为高压输送(最高输送压力可达 4.9107Pa);色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料 填充而成
2、，从而使柱效大大高于经典液相色谱(每米 塔板数可达几万或几十万)；同时柱后连有高灵敏度 的检测器，可对流出物进行连续检测。,二、特点 1高压： 液相色谱法以液体为流动相（称为载液）， 液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通 过色谱柱，必须对载液施加高压。一般可达150 350105Pa。 2. 高速： 流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般 可达110ml/min。高效液相色谱法所需的分析时 间较之经典液相色谱法少得多，一般少于 1h 。,3. 高效： 近来研究出许多新型固定相，使分离效率大 大提高。 4.高灵敏度： 高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器， 进一步提高了分析的灵敏度。如
3、荧光检测器灵敏度 可达10-12g。另外，用样量小，一般几个微升。,5.适应范围宽： GC与HPLC的比较：GC虽具有分离能力好，灵敏 度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术 条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质 都难于应用气相色谱法进行分析。而HPLC，只要求 试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥 发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子 量大（大于 400 以上）的有机物（这些物质几乎占 有机物总数的 75% 80% ）原则上都可应用高效 液相色谱法来进行分离、分析。 据统计，在已知化 合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相 色谱分析的约占7080%。,
4、第一节 高效液相色谱法的主要类型和原理,一、高效液相色谱法的主要类型 根据分离机制的不同，高效液相色谱法可分为下述几种 主要类型： 1 液 液分配色谱法(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化学键合相色谱(Chemically Bonded Phase Chromatography) a. 正相液 液分配色谱法(Normal Phase liquid Chromatography): 流动相的极性小于固定液的极性。 b. 反相液 液分配色谱法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流动相的极性大于固定液的极性。,
5、c.液液分配色谱法的缺点： 尽管流动相与固定相的极性要求完全不同，但 固定液在流动相中仍有微量溶解；流动相通过色谱 柱时的机械冲击力，会造成固定液流失。上世纪70 年代末发展的化学键合固定相（见后），可克服上 述缺点。现在应用很广泛（7080%）。 2液固色谱法 3离子交换色谱法(Ion-exchange Chromatography),凡是在溶剂中能够电离的物质通常都可以用离子交换 色谱法来进行分离。,4 .离子对色谱法(Ion Pair Chromatography) 离子对色谱法是将一种 ( 或多种 ) 与溶质分子 电荷相反的离子 ( 称为对离子或反离子 ) 加到流动 相或固定相中，使其
6、与溶质离子结合形成疏水型离 子对化合物，从而控制溶质离子的保留行为。其原 理可用下式表示： X+水相 + Y-水相 = X+Y-有机相 离子对色谱法(特别是反相)发解决了以往难以 分离的混合物的分离问题，诸如酸、碱和离子、非 离子混合物，特别是一些生化试样如核酸、核苷、 生物碱以及药物等分离。,5 .离子色谱法(Ion Chromatography) 用离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动 相。以电导检测器为通用检测器，为消除流动相中 强电解质背景离子对电导检测器的干扰，设置了抑 制柱。试样组分在分离柱和抑制柱上的反应原理与 离子交换色谱法相同。 离子色谱法是溶液中阴离子分析的最佳方法。 也
7、可用于阳离子分析。,6 .空间排阻色谱法(Steric Exclusion Chromatography) 空间排阻色谱法以凝胶 (gel) 为固定相。它类似于分子 筛的作用，但凝胶的孔径比分子筛要大得多，一般为数纳米 到数百纳米。溶质在两相之间不是靠其相互作用力的不同来 进行分离，而是按分子大小进行分离。分离只与凝胶的孔径 分布和溶质的流动力学体积或分子大小有关。试样进入色谱 柱后，随流动相在凝胶外部间隙以及孔穴旁流过。在试样中 一些太大的分子不能进入胶孔而受到排阻，因此就直接通过 柱子，首先在色谱图上出现，一些很小的分子可以进入所有 胶孔并渗透到颗粒中，这些组分在柱上的保留值最大，在色 谱
8、图上最后出现。,二、液相色谱法固定相 液-液色谱法及离子对色谱法固定相 与GLC类似，LLC的固定相也是在担体上涂渍一层 固定液构成，或使用化学键合相。 1.担体 所用的担体可分为如下几类： 全多孔型担体： 表层多孔型担体（薄壳型微珠担体）：,2固定液 液液色谱流动相和固定相都是液体，因此 要求两相要互不相溶。在液-液色谱中常用的固定 也只有极性不同的几种，如，-氧二丙腈、聚 已二醇-400和角鲨烷等。 3化学键合固定相 将固定液机械的涂在担体表面上构成的这种 固定相，在实际使用时存在不少缺点，20世纪60 年末发展起来了一种新型的固定相-化学键合固 定相。,即用化学反应的方法通过化学键把有机
9、分子结 合到担体表面。根据在硅胶表面 (具有SiOH基 团) 的化学反应不同，键合固定相可分为：硅氧碳 键型 ( SiOC ) ；硅氧硅碳键型 (SiO SiC ) 硅碳键型（SiC）和硅氮键型（Si N）四种类型。,化学键合固定相具有如下一些特点： . 表面没有液坑，比一般液体固定相传质快得多 . 无固定液流失，增加了色谱柱的稳定性和寿命； . 可以键合不同官能团，能灵活地改变选择性，应 用于多种色谱类型及样品的分析； . 有利于梯度洗提，也有利于配用灵敏的检测器和 馏分的收集。,液固吸附色谱法固定相 采用的吸附剂有硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰 胺等，仍可分为全多孔性和薄壳型两种，其特点如 前
10、所述。 离子交换色谱法固定相 1.薄膜型离子交换树脂:即以薄壳玻璃珠为担体，在 它的表面涂约 1% 的离子交换树脂而成。 2. 离子交换键合固定相:用化学反应将离子交换基团 键合在惰性担体（如微粒硅胶）表面。 树脂类别： （1） 阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性）； （2） 阴离子交换树脂（强碱性、弱碱性）。,排阻色谱法固定相 1. 软质凝胶：如交联葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等，适用于水为流动相，在常压下使用。 2. 半硬质凝胶：如苯乙烯二乙烯基苯交联共聚凝胶（交联聚苯乙烯凝胶），是应用最多的有机凝胶，适用于非极性有机溶剂。 3. 硬质凝胶：如多孔硅胶、多孔玻璃等，多孔硅胶是用得较多的无机凝胶。 化
11、学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。 近年来发展起来的可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。用它固定相，色谱柱易填充均匀；柱压、流动相流速、pH值或离子强度对分离的影响小，适用于较高流速下操作。,三、液相色谱法流动相 在气相色谱中，载气是惰性的（与组分分子之 间的作用力可忽略不计），常用的只有三四种，他 们的性质差异也不大，所以要提高柱子的选择性， 只要选择合适的固定相即可。但在液相色谱中，当 固定相选定后，流动相的种类、配比能显著的影响 分离效果，因此，流动相的选择也非常重要。,选择流动相（又称为：淋洗液，洗脱剂）时应注 意下列几个因素 (1) 流动
12、相纯度：防止微量杂质长期累积损坏色谱柱 和使检测器噪声增加。 (2) 避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损 坏柱子。如在液-液色谱中，流动相应与固定液互不 相溶，否则，会使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏 氧化铝固定相等。,(3) 对试样要有适宜的溶解度：试样在流动相中应 有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。 (4) 溶剂的粘度小些为好：否则，会降低试样组分的 扩散系数，造成传质速率缓慢，柱效下降。 (5) 应与检测器相匹配：例如，当使用紫外检测器 时，流动相不应有紫外吸收。,在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依 据。例如，采用正相液-液分配分离时：首先选择中 等极性溶剂，若组分的保
13、留时间太短，降低溶剂极 性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其 中的极性溶剂，使保留时间缩短。 常用溶剂的极性顺序： 水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙 酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯 四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小)。,除此之外，在选择溶剂时，溶剂的极性是 最重要的依据，有时还需要采用二元或多元 组合溶剂作为流动相，以灵活调节流动相的 极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰 时间。选择时要参阅有关手册，并通过实验 确定。,四、影响色谱峰扩展及色谱分离的因素 液相色谱速率理论影响色谱峰扩展因素 1. 涡流扩散项A =
14、 2dp 其含义与气相色谱法相同。 2.纵向扩散项 由于分子在液相中扩散系数比气相中要小得多，一般小 45个数量级。故在液相色谱中，此项可以忽略不计。 3传质阻力项 可分为固定相传质阻力项和流动相传质阻力项。 提高柱效的途径：减小填料粒度以加快传质速 率；提高柱内填料装填的均匀性。,影响分离的因素流速 液相色谱H-u曲线与其气相色谱不同，是一段 斜率不大的直线，只是因为分子扩散相对H值的影 响可以忽略不计。在液相色谱中，使用较高流速， 柱效不会明显下降，有利于实现快速分离。,高效液相色谱法的基本原理与气相色谱法相同。只是由于流动相不同，van Deemter方程式有差别： 主要表现在HPLC组分在色谱柱中的纵向扩散可以忽略。其次是HPLC的色谱柱的柱效（H）与流动相流速（u）与GC有较大的不同。 HPLC中可近似认为H与u成正比，最佳流速无实用意义。,
