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1、小鼠IL-10基因的克隆 及其原核表达,林臻桢 07生技2班 2007060319,IL-10简介,姓 名：白细胞介素 10 （IL-10） 曾用名：细胞因子合成抑制因子（ CSIF） , 出身地：主要由Th2细胞产生, Tho细胞,Th细胞,CD8+T 细胞,活化的B细胞,单核-巨噬细胞,kupffer细 胞,肝细胞,角化细胞等,缺 点：短暂的自限性分泌, 在一般水平 IL-10 的分泌量都很低 只有在特殊的诱导和刺激下才可能 出现高水平的表达。,光荣事迹：细胞因子在免疫调节和炎症反应上有多重 性。它可下调节的Th1细胞因子的反应， MHC类抗原表达，巨噬细胞共刺激分子。 它也提高B细胞生存
2、，增殖，抗体的生产。 这可以阻止细胞因子NF -B活性，并在 JAK - STAT信号通路的调节。,根据 GenBank 中报道的小鼠 （登录号NM-010548 ）IL210mRNA 序列设计特异性引物 P1 和 P2,预期扩增长度为537bp。 P1:5GGATCCATGCCTGGCTCAGCACTGCTATGCTGCCTGCTCTT3 P2:5AAGCTTTTAGCTTTTCATTTTGATCATCATGTATGC3,于37 下用MEM培养液（ 8%的犊牛血清， 10mg/L 刀豆素 ConA 以及 1% 双抗(终浓度为100 g/mL 青霉素、链霉素 )进行培养。,根据总 RNA 提取
3、试剂盒说明,技术路线,总 RNA 的提取,脾细胞的制备,IL210 基因的 RT-PCR 扩增,PCR 产物凝胶回收克隆及序列测定,原核表达载体 pET2IL210 的构建,IL210 在大肠杆菌中的表达及其检测,引物的设计与合成,酶切位点：BamH Hind,大肠杆菌JM109感受态细胞,含Amp 100 g/mL 的LB 培养基 37 振荡培养 16h,pMD18-T,提取质粒,用限制性内切酶（BamH、Hind ） 酶切和 PCR 方法鉴定 获得重组质粒 命名为pT-IL-10,质粒 pT-IL-10,BL21宿主菌,双酶切、回收片段、连接,转 化,质粒 pT-IL-10,原核表达载体 pET28a,pETIL-10,原核表达载体pET28a,IPTG诱导剂量为 1L/mL的pETIL-10,M,IPTG诱导剂量为1.5L/mL和2.0L/mL的pETIL-10,M,BL21菌未诱导,转染重组pETIL-10诱导的BL21的免疫印记,southern印迹杂交,
