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1、阿托伐他汀对人结肠癌裸鼠移植瘤的影响在世界范围内，大肠癌是位居第四的恶性肿瘤。目前，北京市和上海市大肠癌在恶性肿瘤排名已上升到第 2 位，因此研究大肠癌的防治具有重要意义。他汀类药物的抗肿瘤作用是近年来的研究热点之一，这类药物不仅具有抑制多种肿瘤生长的作用，尚可减少心血管急症的发生率、保护糖尿病患者的内皮细胞功能，从而对肿瘤、冠心病、糖尿病这三种严重威胁人类健康的疾病均有保护作用1-2。我们曾对阿托伐他汀对人结肠癌细胞增殖的抑制作用及HSP70表达的变化进行了初步探讨3，但肿瘤细胞在体内、体外的生物学行为有所不同，体外实验的结果不代表体内过程。为进一步探讨阿托伐他汀在体内对结肠癌生长的影响，本
2、实验建立了人结肠癌colo-320细胞裸鼠移植瘤模型，观察阿托伐他汀对移植瘤生长的影响，以及HSP70表达水平的变化，为他汀类药物应用于临床提供有价值的理论依据。1材料与方法1. 1材料 人结肠癌colo-320细胞株购于中科院上海细胞库，12只(14-16g)雄性BALB/C 裸小鼠购于中科院上海实验动物中心，阿托伐他汀钙标准品由北京红惠公司惠赠，HSP70单克隆抗体购自Santa Cruz公司。S-P免疫组化试剂盒、 DAB显色试剂盒购自北京中杉生物公司。1. 2方法1.2.1 colo-320细胞悬液的制备colo-320细胞采用RPMI 1640 完全培养基培养, 含10% 小牛血清。
3、取对数生长期细胞,制成细胞悬液浓度为1108 /ml 。1.2.2 动物实验 雄性BALB/C 裸小鼠共12只，计数为1107的细胞（体积为0.1 ml）接种于裸鼠右前肢腋下，成瘤(移植瘤直径达5mm)后随机分为实验组和对照组，实验组每日经口给予阿托伐他汀,给药量为10mg/kg，对照组每日经口给予PBS，体积均为100l，喂养4周后处死。剥取移植瘤，天平称重，取少量组织块在10%中性福尔马林中固定，其余组织液氮保存。1.2.3 大体观察观察裸鼠的生长变化, 每4天记录裸鼠体重、肿瘤体积。肿瘤体积的计算方法为：V=1/ 2 最大直径最小直径2，实验结束时测量肿瘤重量，计算肿瘤生长抑制率，肿瘤生
4、长抑制率= (对照组肿瘤体积治疗组肿瘤体积) 对照组肿瘤体积100 %。1.2.4 组织学检查标本经10%甲醛固定, 石蜡包埋, HE 染色, 光镜观察移植瘤组织形态。1.2.5 免疫组织化学染色法检测HSP70蛋白的表达 取裸鼠肿瘤组织制成石蜡切片，二甲苯脱蜡，微波炉修复抗原，体积分数为0. 3 % H2O2 30 min 去除内过氧化酶，PBS 洗涤，正常血清室温封闭30 min，分别滴加一抗(1:200)50l，用PBS代替一抗作阴性对照，4 过夜,其余步骤按试剂盒说明书进行。HSP70表达的评分标准按Koga H 等4 方法进行。显色强度分为4级：0=无色，1=浅黄色，2=黄色，3=棕
5、黄色；阳性细胞范围分为5级：0=0%，1=1%25%，2=2650%，3=51%75%，4=76%100%。每张切片的染色积分以显色强度积分与阳性细胞范围积分的乘积表示。规定积分0. 05)，表明阿托伐他汀对裸鼠体质量增长没有显著影响。2.2 阿托伐他汀对结肠癌裸鼠移植瘤体积的影响实验结束时实验组、对照组肿瘤体积分别为1.580.42 cm3，2.590.56cm3，两组之间差异有显著性，对照组肿瘤体积大于实验组（P0.05），肿瘤生长抑制率为39.18%。提示阿托伐他汀对肿瘤的生长有抑制作用。2.3阿托伐他汀对裸鼠移植瘤重量的影响实验结束时实验组、对照组裸鼠移植瘤的重量依次为1.520.38
6、g,2.490.43g,统计学检验结果表明两组移植瘤重量的差异有显著性（P0.05），提示阿托伐他汀能够抑制结肠癌裸鼠移植瘤的生长。2.4 病理组织学变化两组移植瘤组织均呈人结肠癌低分化腺癌表现。实验组癌组织有较多坏死灶, 组织结构不清, 伴有炎细胞浸润,对照组的癌细胞呈团块状分布。2.5 SP法检测阿托伐他汀对裸鼠移植瘤组织中HSP70蛋白表达的影响 HSP70阳性物质呈棕黄色颗粒状,主要分布于肿瘤细胞的胞浆中。阿托伐他汀实验组HSP70蛋白表达显著高于对照组( P 0. 05) ，见表1。表1 HSP70在裸鼠移植瘤组织中的表达情况组别 阳性 阴性 阳性率 染色积分实验组 6 0 100%
7、 6.51.76对照组 4 2 66.67% 4.31.372.6 Western blot检测阿托伐他汀对裸鼠移植瘤组织中HSP70蛋白表达的影响Western Blot研究方法表明，阿托伐他汀实验组HSP70蛋白表达强度为2.410.06，对照组HSP70蛋白表达强度为1.890.02，t=25.36，P005。二者相比，阿托伐他汀实验组HSP70蛋白表达强度显著增高(图1) A CHSP70 70KD-actin 42KD 图1 HSP70蛋白表达（蛋白样品150g） A为阿托伐他汀实验组,C为对照组 3 讨论越来越多的研究证实他汀类药物在抗增殖、诱导凋亡及抑制肿瘤细胞侵袭转移方面的作用
8、,但他汀类药物能否最终成为抗肿瘤药物尚需进一步研究1。本研究为进一步观察他汀类药物对结肠癌增殖的抑制作用，建立了裸鼠移植瘤模型，采用灌胃的方式全身给药，使肿瘤的生长环境更接近于临床实际。实验结果表明，阿托伐他汀能够抑制肿瘤生长；HE染色结果进一步表明在阿托伐他汀实验组移植瘤组织中有较多的坏死灶，而对照组的癌组织则呈团块状分布，提示阿托伐他汀对肿瘤生长的抑制作用与其引起肿瘤组织部分坏死有关。为了进一步在活体水平探讨阿托伐他汀对结肠癌生长抑制的作用机制，我们在体外实验的基础上4，采用免疫组织化学方法及Western blot，再次检测了裸鼠移植瘤组织中HSP70蛋白的表达水平，结果均表明阿托伐他汀
9、能够上调肿瘤组织中HSP70蛋白的表达水平。HSP70表达增高对于机体肿瘤生长的抑制具有重要意义。HSP家族具有在细胞内与自我或非我蛋白的降解产物多肽非共价键结合的生物学特性，形成HSP-肽复合物，带有该细胞的特征性指纹，它所结合的抗原肽可以是肿瘤抗原、细菌抗原、病毒抗原等。当细胞出现应激或细胞坏死时，HSP-肽复合物暴露在细胞表面或释放到细胞外环境中，被周围的抗原递呈细胞摄取并通过其独特的MHC I类途径交叉递呈到细胞表面，激发机体产生抗原肽非依赖的固有性免疫应答和抗原肽依赖的适应性免疫应答，后者主要是细胞毒性T细胞(CTL)反应。由于CTL反应在机体杀伤肿瘤细胞中发挥了关键作用，因而以HS
10、P为基础的肿瘤疫苗成为近年的研究热点5。 本研究结果表明，在活体水平，当阿托伐他汀施药剂量为10 mgkg-1.d-1时，可以抑制结肠癌的生长，HSP70蛋白表达水平的增高可能是阿托伐他汀抑制结肠癌生长过程中的一个重要分子事件。本研究为结直肠癌的防治提供了一种新的思路，为临床应用他汀类药物防治结肠癌提供了实验依据。 参考文献1 Hindler K, Cleeland CS, Rivera E,et al. The role of statins in cancer therapy. Oncologist,2006,11(3):306-315.2 Ceriello A,Assaloni R,Da
11、 Ros R,et al. Effect of atorvastatin and irbesartan, alone and in combination, on postprandial endothelial dysfunction, oxidative stress, and inflammation in type 2 diabetic patients. Circulation,2005,111(19):2518- 2524.3刘蔚，李建生，王忠振.阿托伐他汀抑制结肠癌细胞增殖作用的研究.中华消化杂志,2007,27(8):561.4 Koga H, Sakisaka S, Ohis
12、hi M,et al. Expression of cyclooxygenase-2 in human hepatocellular carcinoma: relevance to tumor dedifferentiation . Hepatology，1999,29(3):688-696.5 Hauser H, Shen L, Go QL, et al. Secretory heat-shock protein as a dendritic cell-targeting molecule: a new strategy to enhance the potency of genetic vaccines. Gene Therapy,2004,11(11):924-932.
