《北京大学《药物毒理学》2毒理学实验基础-药学修改后》由会员分享，可在线阅读，更多相关《北京大学《药物毒理学》2毒理学实验基础-药学修改后（72页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、毒理学研究设计及 实验基础,The Design of Toxicology Study & Foundations of Toxicology Experiment,1,本章的学习目的,学习了解毒理学研究的基础（方法和手段） 实验的设计 实施 观察 结果评价方法 科学手段上的毒理学： 实验科学（以动物实验为中心）,2,一.药物的研发流程,总的来说新药的研发分为两个阶段： 研究和开发。 这两个阶段是相继发生有互相联系的。区分两个阶段的标志是候选药物的确定，即在确定候选药物之前为研究阶段，确定之后的工作为开发阶段。,3,1.药物的研究,研究阶段包括四个重要环节 ： （1）靶标的确立 （2）模型的
2、确立 （3）先导化合物的发现 （4）先导化合物的优化,4,2.药物的开发,开发阶段也包括四个重要环节 ： （1）临床前试验：由制药公司进行的实验室和动物研究，以观察化合物针对目标疾病的生物活性，同时对化合物进行安全性评估。 （2）研发中新药申请（Investigational New Application, IND） （3）临床试验：（ 期、期、期、期 ） （4）新药申请（New Drug Application, NDA）,5,临床前研究,（1） 药学研究： （2）药效学研究：评价化学物质的生物活性和确定药物作用机理。 （3）一般药理学研究：指对新药主要药效作用以外广泛药理作用的研究。主要
3、是药物作用特征、对机体重要系统（神经、心血管、呼吸系统）的影响。 （4）药代动力学研究(ADME) （5）毒理学研究,6,二.为什么要进行毒理学试验？,毒理学试验是对药物安全性评价的主要手段，各国际组织或各国的行政部门所颁布的规程或指南已将毒理学实验列为常规试验，也称为法规(管理)毒理学试验（regulatory toxicology test），这类毒理学试验是以筛查和描述药物的毒性为目的，属于描述毒理学范畴。,7,毒理实验种类,1.体内试验： 2.体外试验： 3.人体调查和流行病学调查：,8,三.毒理学实验的原则和局限性,1.基本原则（三个原则） 第一原则：药物在实验动物产生的作用，可以外
4、推于人。 第二原则：实验动物必须暴露于高剂量受试物。 第三原则：选择成年的健康（雄性和雌性未孕）实验动物和人可能的暴露途径。,9,2.利用动物实验的局限性,不确定性：用实验动物的毒理学试验资料外推到人群接触的安全性时，会有很大的不确定性。“给人使用时总是不可避免地要冒一定的风险。”（要知己知彼） 不确定性的产生：药物的毒性作用受到许多因素的影响。 1.实验动物和人对药物的反应敏感性不同，有时甚至存在着质的差别。（症状和体征） 2.试验中选用较大的染毒剂量，有些药物在高剂量和低剂量的毒性作用规律并不一定一致。 3.毒理学试验所用动物数量有限，那些发生率很低的毒性反应，在少量动物中难以发现。 4.
5、实验动物一般都是实验室培育的品系，一般选用成年健康动物，反应较单一。,10,3.毒理实验的重要原则,（1）贯彻优良实验室规范(GLP) （2）尊重动物福利（3R原则）,11,四.毒性评价试验的基本目的,1.药物毒作用的表现和性质 2.剂量-反应(效应)研究 3.确定毒作用的靶器官 4.确定损害的可逆性 5.其它 （1）毒作用的敏感检测指标和生物学标志 （2）毒作用机制研究 （3）受试物的毒物动力学和代谢研究 （4）中毒的解救措施,12,四.毒性评价试验的基本目的,1.药物毒作用的表现和性质 2.剂量-反应(效应)研究 3.确定毒作用的靶器官 4.确定损害的可逆性 5.其它 （1）毒作用的敏感检
6、测指标和生物学标志 （2）毒作用机制研究 （3）受试物的毒物动力学和代谢研究 （4）中毒的解救措施,13,剂量-反应(效应)研究,是毒性评价和安全性评价的基础。通过对不同有害作用的剂量-反应(效应)研究，可以得到该受试物的多种毒性参数。 急性(致死性)毒性试验：LD50、LD01和MTD。 急性非致死性毒性试验中：急性可观察到有害作用的最低剂量 (LOAEL)和未观察到有害作用的剂量(NOAEL)。 亚急性、亚慢性及慢性毒性试验：相应的LOAEL和NOAEL。 致畸试验：LOAEL和NOAEL 致突变、致癌试验：表观的LOAEL和NOAEL。,14,四.毒性评价试验的基本目的,1.药物毒作用的
7、表现和性质 2.剂量-反应(效应)研究 3.确定毒作用的靶器官 4.确定损害的可逆性 5.其它 （1）毒作用的敏感检测指标和生物学标志 （2）毒作用机制研究 （3）受试物的毒物动力学和代谢研究 （4）中毒的解救措施,15,四.毒性评价试验的基本目的,1.药物毒作用的表现和性质 2.剂量-反应(效应)研究 3.确定毒作用的靶器官 4.确定损害的可逆性 5.其它 （1）毒作用的敏感检测指标和生物学标志 （2）毒作用机制研究 （3）受试物的毒物动力学和代谢研究 （4）中毒的解救措施,16,四.毒性评价试验的基本目的,1.药物毒作用的表现和性质 2.剂量-反应(效应)研究 3.确定毒作用的靶器官 4.
8、确定损害的可逆性 5.其它 （1）毒作用的敏感检测指标和生物学标志 （2）毒作用机制研究 （3）受试物的毒物动力学和代谢研究 （4）中毒的解救措施,17,五.毒理学试验设计,18,19,五.毒理学试验设计要点,1剂量分组 一般至少要设3个剂量组 高剂量组 中剂量组 低剂量组 希望能得到满意的剂量-反应(效应)关系。,(一) 体内毒理学试验设计,20,未处理对照组（空白对照组）：确定本底值，进行质量控制（常用于遗传毒理学试验） 阴性（溶剂）对照：是染毒组比较的基础 阳性对照：检测试验体系的有效性 历史性对照：检测试验体系的稳定性,对照组问题,毒理学实践的基本手段之一就是比较分析。,21,2各组动
9、物数 3试验期限,22,1.测定药物的溶解性 2.试验最高剂量的推荐 3.代谢活化 4.阳性对照 5.重复,（二）体外毒理学试验设计,23,24,六.药物,1.受试样品的准备,纯度及杂质成分 化学结构和理化性质（挥发性和溶解性） 相似化合物的毒性参考资料 同种同一批号 成分和配方必须固定 稳定性受试物应一次备齐全部实验的用量。,25,受试物的准备,剂型：水溶液、油溶液或混悬液 对溶剂和助溶剂的要求：无毒，与受试物不起反应，稳定。 制剂要点 染毒容积：以受试的实验动物物种或制剂来确定。,26,1.在制备制剂时加热受试物不应接近或者达到改变其化学性质或者物理性质的温度,2.在评价固体受试物皮肤毒性
10、时，应保持其形状和颗粒大小,3.多成分的受试物应按照配方配制，使染毒制剂准确反映原混合物,4.制剂应保持化学稳定性和一致性,5.制剂应减少总试验容积，利用溶剂或赋形剂的量不应过多。,6.制剂应易于准确染毒,7.制剂的pH应为5-9.,8.不应用酸碱解离受试物，基于保护动物的原因，并避免改变肠道或者 肾小管内的pH值,9.非胃肠道染毒，受试物应尽可能接近等渗,27,28,29,化学结构对其毒性的影响,同系物的碳原子数：烷、醇、酮等碳氢化合物按同系物相比，碳原子数愈多，则毒性愈大(甲醇与甲醛除外)。但当碳原子数超过一定限度时(79个)，毒性反而迅速下降。 取代基团：卤代烷烃、基团的位置不同也可能影
11、响毒性 分子中不饱和键 构型异构：顺反异构和手性异构,30,31,药物的理化性质,溶解度： 水溶性：化学物在水中的溶解度直接影响其毒性大小，溶解度愈大，毒性愈大。 脂溶性：脂溶性物质易在脂肪中蓄积，易侵犯神经系统。 挥发度： 分散度 纯度和杂质：药物的纯度常常改变其毒性,32,北医三院眼科用药,33,上海华联抗癌药(甲氨喋呤、阿糖胞苷) 致残130多人(其中因厂方瞒报药品被污染事实，导致真相延迟揭示，药害例数增加数十人)，症状为下肢疼痛乏力、进而行走困难瘫痪等。 调查原因：存在严重的质量管理混乱,导致在5方面违规生产行为。部分批次产品中混入了微量硫酸长春新碱另一种不能用于鞘内注射的抗肿瘤药物（
12、生产尾料未交三废处理人员，而由灌装工收集存放于储藏室，继续用于生产）。,鞘内注射甲氨蝶呤致患者双腿瘫痪变形,34,越战中美军使用落叶剂2、4、5-T（橙剂）,TCDD,35,36,七.实验动物的选择和处理,毒理学的动物试验是以实验动物作为研究对象的，为获得可靠的研究结果，先决条件是正确地选用实验动物。,37,(一)实验动物物种的选择基本原则,对受试物在代谢、生物化学和毒理学特 征与人最接近的物种 敏感的物种 自然寿命不太长的物种 易于饲养和实验操作的物种;经济并易于获得的物种,38,动物物种,大鼠 小鼠 豚鼠 兔 狗,地鼠 弥猴 小型猪 鸡 等等。,39,表1 常用实验动物生物学和生理学参数,
13、40,背肿了,41,（二）实验动物品系的选择,1.近交系：C57、Balb/c、dba-1；shrn、ZDF大鼠、F344/DuCrlCrlj大鼠 2.杂交群动物： 3.封闭群：昆明种、ICR小鼠； F344大鼠、SD大鼠、wistar大鼠等,42,（三）对实验动物微生物控制的选择,43,（四）个体选择,性别 年龄和体重 生理状态 健康状况,44,45,皮肤癌： 饮酒：,46,47,（五）饲养条件,合理的全营养饲料 水 温度和湿度 空气清洁度 人工照明的昼夜周期,48,（六）国家有关实验动物的质量 监督和质量合格证制度,1998年实验动物管理条例 试验动物微生物学和寄生虫学检测等级 实验动物哺
14、乳类动物遗传质量控制 实验动物全价营养饲料 实验动物环境及设施,49,50,八.实验动物的染毒和处置,雌雄分开饲养 57天的检疫（适应环境） 标记和分组。 实验动物分组的原则 要求所有的动物分配到各剂量组和对照组的机会均等，避免主观选择倾向，减少偏性，以保证结果的准确可靠。 正确的分组方法：随机分组,(一)动物实验前的准备,51,(二)染毒途径,选择原则： 应尽可能模拟人在接触该受试物的方式 途径：经口、经呼吸道、经皮及注射途径 1.经口(胃肠道)染毒：灌胃、喂饲和吞咽胶囊 2.经呼吸道染毒：吸入染毒（静式、动式）和气管内注入 3.经皮肤染毒：备皮 4.注射染毒：肌肉、皮下和静脉滴注（ip）,
15、52,（1）经口(胃肠道)染毒,灌胃、喂饲和吞咽胶囊 喂饲：5%,53,(二)染毒途径,选择原则： 应尽可能模拟人在接触该受试物的方式 途径：经口、经呼吸道、经皮及注射途径 1.经口(胃肠道)染毒：灌胃、喂饲和吞咽胶囊 2.经呼吸道染毒：吸入染毒（静式、动式）和气管内注入 3.经皮肤染毒：备皮 4.注射染毒：肌肉、皮下和静脉滴注（ip）,54,（2）经呼吸道染毒：,55,(二)染毒途径,选择原则： 应尽可能模拟人在接触该受试物的方式 途径：经口、经呼吸道、经皮及注射途径 经口(胃肠道)染毒： 经呼吸道染毒： 经皮肤染毒：备皮 注射染毒,56,57,药物的联合作用 一种药物对机体的毒性作用，可以
16、由于同时或先后接触另一种药物而使其所表现的联合毒性比任一单一药物的毒性增强或减弱，毒理学将两种或两种以上的药物对机体的交互作用称为联合作用(joint action)。,58,类型 相加作用(additional joint action) 协同作用(synergistic effect) 加强作用(potentiation joint action) 拮抗作用(antagonistic joint action) 独立作用(independent effect ),59,60,(三)实验动物处死及生物标本采集,1.实验动物处死方法 2.血液采集 3.尿液采集 4.病理解剖和标本留取 5.大体解剖 在实验动物处死后半小时内进行，解剖方法采用胸腔、腹腔脏器联合取出法。应观察有关脏器的外形和表面情况、颜色、边界和大小、质地、切面。对指定的脏器称重，并计算脏器系数。,61,病理解剖标准操作程序(大体解剖),动物固定在解剖板上，解剖颈
