土壤微生物生物量的测定方法(氯仿熏蒸)

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1、土壤微生物生物量的测定方法1 土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取-仪器分析法）1.1 基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h） ，土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的 0.5mol/LK2SO4 溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC） ，从而计算土壤微生物生物量碳。1.2 实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC500,JANPAN） 、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。1.3 实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL 3） ；2）0.5

2、mol/L 硫酸钾溶液：称取 87g K2SO4 溶于 1L 蒸馏水中3）工作曲线的配制：用 0.5mol/L 硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L 系列标准碳溶液。 （其实一般情况下， 仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）1.4 操作步骤1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略）1.4.2 熏蒸称取新鲜（相当于干土 10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入 25ml 小烧杯中。将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约 2/3）的 15ml 烧杯 2 或 3 只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有 Na

3、OH 溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的 CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾 5 分钟。关闭真空干燥器阀门，于 25黑暗条件下培养 24 小时。1.4.2 抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做） ，取出盛有氯仿（可重复利用）和稀 NaOH 溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5 或 6 次，每次 3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子） ，直到土壤无氯仿味道为止。同时，另称等量的 3 份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。 （注意：熏蒸后不可久放，应该快速浸提）1.4.4

4、浸提过滤从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到 80ml 聚乙烯离心管中，加入 40ml 0.5mol/L 硫酸钾溶液（土水比为 1:4，考虑到土样的原因，此部分熏蒸和不熏蒸土均为 4g，即，4g 土：16ml 的硫酸钾溶液，当然这个加入量要根据 TOC 仪器的进入量决定）300r/min 振荡 30min，用中速定量滤纸过滤。同时作 3 个无土壤基质空白。土壤提取液最好立即分析，或20冷冻保存（但使用前需解冻摇匀） （注意这部分很重要，有研究结果表明：提取液如果不立即分析，请保存在20，否则将影响浸提液的效果，其次，过滤时不要用普通的定性或定量滤纸，以免长久杂质会堵塞仪器的管路，建

5、议使用那种一次性塑料注射器，配一个 0.2um 的滤头，一个才 1 元 ） 。1.4.5 TOC 仪器测定吸取上述土壤提取液 10ul（这个要根据仪器自己的性能决定，但是一般情况下，在测定土壤滤液时候，要对其进行稀释，如果不稀释，一方面超过原来仪器的标曲，另一方面可能堵塞仪器。 ）注入自动总有机碳（TOC）分析仪上，测定提取液有机碳含量。由于总有机碳分析仪型号较多，不同的型号则操作程序存在较大差异，这里以本实验室使用的有机碳分析仪（Shimadzu Model TOC-500,JAPAN）为例。1.5 计算SMBC=(ECCHCL3ECCK)*TOC 仪器的稀释倍数*原来的水土比/0.452

6、土壤微生物生物量氮（茚三酮比色法）土壤微生物生物氮一般占土壤全氮的 2%7%，是土壤中有机无机态氮转化的一个重要环节，关于土壤微生物氮的测定常见的熏蒸浸提法有两种，一是全氮测定法，另一个是茚三酮比色法，如下2.1 基本原理（茚三酮比色法）Amato 和 Ladd（1988 ）研究表明新鲜土样熏蒸过程所释放出的氮，主要成分为 -氨基酸态氮和铵态氮，这两种氮形态可以用茚三酮反应定量测定，并发现熏蒸与未熏蒸土壤提取的茚三酮反应态氮的增量，与其土壤微生物生物量碳之间存在显著的相关性。因此，人们采用熏蒸提取茚三酮比色法来测定土壤微生物生物量氮（FE-Nnin） 。2.2 实验仪器分光光度计、硬质试管、水

7、浴锅、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯塑料管、离心管、漏斗等2.3 实验试剂1）无乙醇氯仿（CH 3Cl） ；2）0.5mol/L (K2SO4)溶液：称取硫酸钾（K 2SO4）87g，溶于去离子水中，稀释至 1000ml；3）pH5.2 的乙酸锂（LiOHH 2O）溶液：称取氢氧化锂（LiOHH 2O）168g，加入冰乙酸（优级纯）279ml，加水稀释到 1000ml，用浓盐酸或 50%氢氧化钠溶 液调节 pH 至 5.2。4）茚三酮溶液：取 150ml 二甲基亚砜（C 2H6OS）和乙酸锂溶液 50ml 加入4g 水合茚三酮（C 9H4O3H2O）和 0.12g 还原茚三酮（ C18H10

8、O62H2O）搅拌至完全溶解；5）50% 乙醇水溶液：吸取 50ml 99%乙醇于 100ml 容量瓶中，用蒸馏水定容；6）1mol/L 的硫酸铵(NH4) 2SO4标准储存液：称取 4.7167g 分析纯硫酸铵（称 前 105烘 2h）溶于 0.5mol/L 硫酸钾溶液中，并用硫酸钾溶液定容至1000ml，摇匀，于 4冰箱中保存。7）0.1mol/L 的硫酸铵(NH4) 2SO4标准液：吸取 10ml 1mol/L 的硫酸铵标准储存液于 100ml 容量瓶中，用 0.5mol/L 硫酸钾溶液定容至 100ml，摇匀。此溶液最好现配现用。8）工作曲线的制备：分别吸取0.00ml、0.50ml、

9、1.00ml、2.00ml、3.00ml、4.00ml、5.00ml 0.1mol/L 的硫酸铵标准液于 100ml 容量瓶中，用 0.5mol/L 硫酸钾溶液 定容至 100ml，摇匀，其浓度分别为0mol/L、0.25mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L、1.5mol/L、2.0mol/L、2.5mol/L 硫酸铵标准氮的系列溶液。2.4 操作步骤2.4.1 土壤的前处理（和 1.4.1 一样）2.4.2 熏蒸（和 1.4.2 一样）2.4.3 抽真空处理（和 1.4.3 一样）2.4.4 浸提过滤从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到 80ml 聚乙烯离心管中，加入

10、40ml 0.5mol/L 硫酸钾溶液（土水比为 1:4，考虑到土样的原因，此部分熏蒸和不熏蒸土均为 2g，即，2g 土：8ml 的硫酸钾溶液） 300r/min 振荡30min，用中速定量滤纸过滤。同时作 3 个无土壤基质空白。土壤提取液最好立即分析，或20冷冻保存（但使用前需解冻摇匀） （注意这部分很重要，有研究结果表明：提取液如果不立即分析，请保存在20，否则将影响浸提液的效果， ，其次，过滤时不要用普通的定性或定量滤纸，以免长久杂质会堵塞仪器的管路，建议使用那种一次性塑料注射器，配一个 0.2um 的滤头，一个才1 元） 。2.4.5 分光光度计比色测定（此处沸水浴不好控制）吸取 0.

11、5ml 样品提取液和标准工作液，分别置于 10ml 的塑料离心管中，加入 2ml 茚三酮显色剂，涡旋搅拌充分混匀，置于试管架上，在沸水中水浴15min，迅速冷却（冰浴约 2min） ，加入 5ml 稀释液（50%乙醇水溶液） ，摇匀于 570nm 下比色。2.5 结果计算SMBN=(ECCHCL3ECCK)*稀释倍数*原来的水土比*5 土壤微生物生物量氮的测定（全氮测定法,建议使用此法）注意：所配的试剂和全自动凯氏定氮仪的试剂一样，具体见农化分析课本2.4.1 土壤的前处理（和 1.4.1 一样）2.4.2 熏蒸（和 1.4.2 一样）2.4.3 抽真空处理（和 1.4.3 一样）2.4.4

12、浸提过滤从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到 80ml 聚乙烯离心管中，加入 40ml 0.5mol/L 硫酸钾溶液（土水比为 1:4，考虑到土样的原因，此部分熏蒸和不熏蒸土均为 4g，即，2g 土：16ml 的硫酸钾溶液） 300r/min 振荡30min，用中速定量滤纸过滤。同时作 3 个无土壤基质空白。土壤提取液最好立即分析，或20冷冻保存（但使用前需解冻摇匀） （注意这部分很重要，有研究结果表明：提取液如果不立即分析，请保存在20，否则将影响浸提液的效果， ，其次，过滤时不要用普通的定性或定量滤纸，以免长久杂质会堵塞仪器的管路，建议使用那种一次性塑料注射器，配一个 0.2u

13、m 的滤头，一个才1 元） 。2.4.5 全自动凯氏定氮仪的测定吸取 10ml 滤液与消煮管中，加入 K2SO4CuSO4Se 混合催化剂 1.08g，加入 4ml 浓硫酸；同时设置 23 空白（10ml 的 0.5mol/l 的 K2SO4，加入K2SO4CuSO4Se 混合催化剂 1.08g，加入 4ml 浓硫酸） ；在高温消化（340消煮 3 个小时）至澄清后放置 2-3h。然后用全自动凯氏定氮仪测定浸提液中的全氮含量。2.5 结果计算EN=(VS-VO)*CH2SO4*14*1000*(16/10)WS式中：E N 为全氮， VO 为滴定空白对照所消耗的标准硫酸体积（注意：消煮一批土样

14、至少需要 3 个对照） ，V S 为滴定土样所消耗的标准硫酸体积，C H2SO4为硫酸浓度（这个浓度要进行标定的，具体见农化分析课本） ，14 为氮的摩尔质量，1000 为千克转化成克，16/10 为从 16ml 的提取液中吸取 10ml，W S 为干土重所以： 土壤微生物生物量氮 Bn=(ENCHCL3ENCK)/0,54见土壤微生物研究原理与方法 ，主编：林先贵 中科院南京土壤研究所3 土壤微生物生物量磷（无机磷测定法）Brookes 等（1982）报道土壤熏蒸处理所释放出来的磷大部分为无机磷酸盐，可被 0.5mol/LNaHCO3 等提取剂提取，而且熏蒸和未熏蒸土壤之间无机磷的差异，能够

15、反映土壤微生物生物量磷的高低。于是，Brookes 等建立了土壤微生物生物量磷的熏蒸提取-无机磷测定法。3.1 基本原理新鲜土壤经氯仿熏蒸后（24h） ，采用 0.5mol/LNaHCO3 溶液提取被杀死的土壤微生物生物量磷，在锑钼抗混合试剂作用下提取液中正磷酸与钼酸络合形成磷钼杂多酸（在一定酸度条件下） ，可用磷钼比色法测定提取液最好全磷含量。根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机磷量的差值和转换系数（kp，这个系数很重要，因为如果没有这个系数，所测定的结果就是土壤的速效磷，但是土壤微生物熏蒸后释放的磷大多数是无机磷，而速效磷包括全部水溶性磷、部分吸附态磷及有机态磷，有的土壤中还包括某些沉淀态磷，

16、因此速效磷和无机磷的范畴不一样，不要搞混 ）以及外加无机磷的回收率（Rpi ）作为校正系数，从而估算土壤微生物生物量磷。3.2 实验设备分光光度计、硬质试管、水浴锅、真空干燥器、离心机、烧杯、三角瓶、聚乙烯塑料管、离心管、漏斗等3.3 实验试剂1）无乙醇氯仿（CH 3Cl） ；2）0.5mol/L 碳酸氢钠（NaHCO 3）浸提液：溶解 NaHCO342.0g 于 800ml 水中，以 0.5mol/LNaOH 溶液调节浸提液的 pH 至 8.5，再用蒸馏水稀释至1000ml。此溶液曝于空气中可因失去 CO2 而使 pH 增高，可于液面加一层矿物油保存。此溶液储存于塑料瓶中比在玻璃瓶中容易保存，若储存超过一个月，应检查pH 是否改变；3）磷酸二氢钾溶液【p（KH 2PO4）=250 ug p /ml】：称取 1.0984g 分析纯磷酸二氢钾（称量前 105烘 23h） ，溶于去离子水并定容至 1000ml；4