生物产品代谢调控发酵机制

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1、第四章 生物产品代谢调控发酵机制,1,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,本章主要内容：,氨基酸代谢调控机制 核酸与核苷酸代谢调控机制 抗生素代谢调控机制,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,2,1 氨基酸代谢调控机制,代谢控制发酵是用遗传学或其他生物化学的方法，人为 地在DNA分子水平上改变和控制微生物的代谢，打破微 生物正常的代谢调节，使有用产物大量生成和积累。,氨基酸发酵和核酸发酵是典型的代谢控制发酵。,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,3,谷氨酸与瓜氨酸、鸟氨酸、精氨酸同属于谷氨酸族氨基酸，其合成途径是首先由-酮戊二酸生成谷氨酸，再进一步合成鸟氨酸、瓜氨酸、精氨酸,一、谷氨酸、鸟氨酸、瓜氨

2、酸、精氨酸生物 合成途径及其代谢调节机制,葡萄糖 谷氨酸鸟氨酸瓜氨酸精氨酸,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,4,谷氨酸属“非必需”氨基酸，是体内代谢的基本氨基酸之一。 在谷氨酰胺合成酶催化下，能与氨反应生成谷氨酰胺由尿 排出，起到解除氨毒作用； 它还参与脑内蛋白质和糖代谢，促进氧化过程，改善中枢 神经系统的功能； 在体内它能转化为丙酮或葡萄糖，因而升高血糖，减少糖 原异生，从而减少脂肪分解，减少酮体。,1.谷氨酸族氨基酸生物合成途径及代谢调节机制,谷氨酸的功能,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,5,肝昏迷预防； 防止癫痫； 减轻酮尿症和酮血症； 胃酸不足； 一种脑营养剂； 食品保鲜剂。,药物

3、 保健品 食品,L-谷氨酸的用途,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,6,HMP途径,谷氨酸代谢途径,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,7,由 葡 萄 糖 生 物 合 成 谷 氨 酸 的 代 谢 途 径,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,8,EMP 途径 HMP 途径 TCA 循环 DCA 循环 CO2 固定,由葡萄糖生成谷氨酸的总反应式：,C6H12O6 + NH3 + O2 C5H9O4N + CO2 + 3H2O,代谢途径：,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,9,由二羧酸和三羧酸生成谷氨酸,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,10,研究证明：,谷氨酸生产菌种存在EMP途径的全部酶和HMP途径

4、有关 的酶,TCA循环中的柠檬酸、顺乌头酸、异柠檬酸能定量地生 成谷氨酸，其相应的酶与谷氨酸合成有关,以醋酸和乙醇为原料进行谷氨酸发酵时，DCA循环是C4 二羧酸的唯一补充来源；但是以葡萄糖为原料时，在谷 氨酸生成期此循环应关闭,谷氨酸菌存在CO2固定生成草酰乙酸的PEP羧化酶和苹果 酸酶，与谷氨酸得率正相关,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,11,大肠杆菌及枯草芽孢杆菌等从谷氨酸到精氨酸生物合成途径及调节机制,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,12,谷氨酸生产菌及酵母菌等从谷氨酸到精氨酸生物合成及代谢调节机制,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,13,在黄色短杆菌中谷氨酸、天冬氨酸生物合成的调

5、节机制,2. 谷氨酸代谢调节机制,谷氨酸脱氢酶 -酮戊二酸脱氢酶 磷酸烯醇丙酮酸羧化酶 柠檬酸合成酶,NH4+,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,14,在微生物的代谢中，Glu比Asp优先合成； 合成过量时则抑制谷氨酸脱氢酶，使代谢转向合成Asp； Asp过量时反馈抑制PEP羧化酶的活力，停止合成草酰乙酸。,NH4+的导入不仅仅证明Glu是氮素同化发酵，它还会抑制 Glu生成的逆反应，因此当NH4+存在时，葡萄糖的消耗速度 很快， Glu的生成很高；但是当生物素充足时，NH4+几乎 不影响糖代谢。,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,15,Glu生产菌大多是生物素缺陷型，发酵时控制生物素亚适 量

6、，使细胞变形拉长，改变了细胞膜的通透性引起代谢失 调使Glu得以积累。,生物素贫乏时，细胞内的Glu含量少而且容易析出，而培 养基中积累大量的Glu；生物素丰富时，培养基中几乎不 积累Glu，而细胞内却含有大量的Glu，且不易被析出。 这说明生物素对细胞膜通透性有重要影响。,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,16,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,17,表面活性剂拮抗作用部位,油酸缺陷型遗传阻碍部位,糖质或醋酸为碳源的磷脂合成途径,甘油缺陷型的遗传阻碍部位,石蜡为碳源的磷脂合成途径,细菌细胞Glu排出控制机制,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,18,丧失或有微弱的-酮戊二酸脱氢酶活力，使-酮戊

7、二酸不能继续氧化； CO2固定能力强，使四碳二羧酸全部由CO2固定反应提供，而不走乙醛酸循环； 谷氨酸脱氢酶的活力很强，并丧失谷氨酸对谷氨酸脱氢酶的反馈抑制和反馈阻遏，同时，NADPH2再氧化能力弱，这会使-酮戊二酸到琥珀酸的过程受阻； 有过量的NH4+ 存在，-酮戊二酸经氧化还原共轭氨基化反应而生成谷氨酸却不形成蛋白质，从而分泌泄漏于菌体外； 同时，谷氨酸生产菌应不利用体外的谷氨酸，使谷氨酸成为最终产物。,3. 谷氨酸高产菌模型特征,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,19,从前图还可以看出： 生产菌株还应该具有生物素合成缺陷、油酸合成缺陷和甘油合成缺陷等特点。,第四章 生物产品代谢调控发酵机

8、制,20,-生物素缺陷型 -油酸缺陷型 -甘油缺陷型 -温度敏感缺陷型 -其它缺陷型,当前Glu生产中的几种缺陷型：,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,21,谷氨酸味精工业生产,味精是Glu单钠盐，学名：-氨基戊二酸一钠，商品 中有一分子结晶水,COOH CNH2 CH2 CH2 COOH,COONaH2O CNH2 CH2 CH2 COOH,L-谷氨酸,L-谷氨酸钠（味精）,H,H,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,22,4. 生产工艺流程：,淀粉 葡萄糖,糖蜜 稀释蜜,配 料 种子罐,发酵罐,玉米浆 糖 蜜 磷酸二氢钾 硫酸镁,无菌空气,Fe2+ 、 Mn2+,NH3,菌种,第四章 生物产

9、品代谢调控发酵机制,23,等电提取,中 和,除 铁,脱 色,浓缩、结晶,离 心,干 燥,味 精,发酵罐,Na2CO3,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,24,谷氨酸族氨基酸的生物合成，是由葡萄糖开始，经EMP途径、HMP途径、TCA循环、DCA循环和CO2固定等，首先合成谷氨酸，再从谷氨酸依次经鸟氨酸、瓜氨酸生物合成精氨酸。,谷氨酸 N-乙酰谷氨酸 鸟氨酸 瓜氨酸 精氨酸,Glu,Orn,Cit,Arg,5. 鸟氨酸发酵机制,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,25,鸟氨酸发酵与瓜氨酸发酵的遗传缺陷位置 (谷氨酸棒杆菌为生产菌),第四章 生物产品代谢调控发酵机制,26,选育瓜氨酸缺陷型（Cit）

10、菌株，即丧失鸟氨酸转氨甲酰酶，解除精氨酸的反馈抑制； 向发酵液中提供瓜氨酸或精氨酸（亚适量），缺陷型才能生长； 在瓜氨酸缺陷型（Cit）的基础上，再选育精氨酸结构类似物抗性突变株（如选育抗精氨酸氧肟酸ArgHx和抗D-精氨酸等），就能遗传性的解除精氨酸的反馈调节。,鸟氨酸生产菌选育模型,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,27,6. 瓜氨酸生物合成与发酵机制（讨论）,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,28,鸟氨酸发酵与瓜氨酸发酵的遗传缺陷位置 (谷氨酸棒杆菌为生产菌),第四章 生物产品代谢调控发酵机制,29,精氨酸发酵不能用阻断代谢流和营养缺陷型来进行，而应用抗反馈调节突变株，选育抗L-精氨酸结

11、构类似物突变株（如D-ArgR、ArgHx等），解除精氨酸自身调节，使精氨酸积累。,7. 精氨酸生物合成与发酵机制,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,30,二、天冬氨酸、赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸 生物合成途径与发酵机制,天冬氨酸Asp， C4H7O4N 赖氨酸 Lys， C6H14O2N2 苏氨酸 Thr， C4H9O3N 蛋氨酸 Met， C5H11O2SN 异亮氨酸 Ile， C6H13O2N,天冬氨酸与赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸同属于 天冬氨酸族的氨基酸,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,31,HMP途径,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,32,天冬氨酸激酶（AK） 高丝氨酸脱氢酶（HD） 二

12、氢吡啶-2,6-二羧酸（DDP）合成酶 高丝氨酸激酶 O-琥珀酰高丝氨酸转琥珀酰酶 半胱氨酸脱硫化氢酶 苏氨酸脱氨酶 天冬氨酸半醛脱氨酶 二氢吡啶-2,6-二羧酸（DDP）还原酶,1. 天冬氨酸族氨基酸的生物合成途径,葡萄糖四碳二羧酸,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,33,2. 天冬氨酸族氨基酸生物合成的代谢调节机制,(1)大肠杆菌中天冬氨酸族氨基酸生物合成的调节机制,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,34,在黄色短杆菌中赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸 和异亮氨酸生物合成的代谢调节,(2)谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌等天冬氨酸族氨基酸的代谢调节机制,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,35,优先合成：葡萄

13、糖经酵解途径生成PYR，PYR 经 CO2 固定和氧化脱羧进入TCA循环，生成草酰 乙酸，再经氨基化反应生成Asp； Met比Thr、 Lys优先合成， Thr比Lys优先 合成。,天冬氨酸激酶是关键酶，AK是变构酶，具有两个变构部 位，可以与终产物Lys和Thr结合，受终产物的反馈控制。,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,36,在黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌等微生物中，AK是单一的，并且受Lys 和 Thr的协同反馈抑制，反馈调节易于解除，使育种简单化，所以常常被用作氨基酸发酵育种的出发菌株。,黄色短杆菌的AK受Lys和Thr协同反馈情况,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,37,“代谢互锁”,乳

14、糖发酵短杆菌中赖氨酸及其前体物生物合成的代谢调节,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,38,在黄色短杆菌中天冬氨酸与乙酰CoA形成的平衡合成,PC,平衡合成：Asp和乙酰CoA形成平衡合成，当乙酰CoA合成过量时，能解除Asp对PEP羧化酶的反馈抑制。,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,39,L-天冬氨酸是酸性氨基酸，属“非必需”氨基酸。 可以作为K+、Mg2+离子的载体向心肌输送电解质，从而改善心肌收缩功能，同时降低氧消耗，在冠状动脉循环障碍缺氧时，对心肌有保护作用。 参与鸟氨酸循环，促使氨和二氧化碳生成尿素，降低血液中氨和二氧化碳的量，增强肝脏功能，消除疲劳。 新型甜味剂的原料。,第四章 生

15、物产品代谢调控发酵机制,40,高产赖氨酸菌的遗传标记位置,3. 赖氨酸发酵机制,（高丝氨酸脱氢酶缺失）,AK,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,41,1）切断或减弱支路代谢，选育高丝氨酸缺陷型（Hom）突变株，或蛋氨酸和苏氨酸或异亮氨酸缺陷型（Met + Thr、Ile）突变株；,2）解除Thr和Lys的协同反馈抑制作用，选育结构类似物抗性突变株，使赖氨酸大量积累，如： S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸抗性株（AECr） L-赖氨酸氧肟酸盐抗性株（LysHxr） 苏氨酸氧肟酸盐抗性突变株（ThrHxr）等；,3）增加Lys前体物Asp的量：切断生成丙酮酸的支路，同时解除Asp对PEP羧化酶（即PC）的反馈抑制；选育丙氨酸缺陷型（Ala）或温度敏感突变株（tmps），中断丙酮酸到Ala的反应；选育AspHxr、磺胺类药物抗性突变株；,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,42,赖氨酸发酵育种所使用的一些结构类似物,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,43,4）在乳糖发酵短杆菌中，Lys的生物合成与亮氨酸（Leu）之 间存在着“代谢互锁”，即赖氨酸分支途径的初始酶二氢吡 啶-2,6-二羧酸（DDP）合成酶受Leu的反馈阻遏（如图）,选育Leu+ LeuHxr或Leu温度敏感突变株,乳