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1、生物技术制药个论,基因工程制药 抗体制药 动物细胞制药 植物细胞制药 酶工程制药 现代生物技术改造传统制药工业,一、基因工程药物种类,细胞因子药物：干扰素、集落因子、白细胞介素、肿瘤坏死因子、趋化因子、生长因子、凝血因子 蛋白质类激素药物：生长激素、胰岛素、胰岛素样生长因子、促卵泡素、甲状旁腺素、降钙素、胰高血糖素、促黄体生成素、甲状腺刺激素和心钠素等。 溶血栓药物：组织型纤溶酶激活剂、尿激酶型纤溶原激活物、蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂、链激酶和葡激酶等。 治疗用酶：超氧化物歧化酶、羧肽酶、尿酸氧化酶、葡糖脑苷脂酶、脱氧核糖核酸酶和胸苷激酶等。 可溶性受体和黏附分子：可溶性补体受体型 其他：血红蛋白
2、、白蛋白等。,重组蛋白质类药物,核酸类药物主要是在核酸水平(DNA和RNA)上发挥作用，它通过纠正突变的基因并使之重新获得适当的功能来治疗或预防疾病。 特点是：能将基因表达的产物的作用局限于病变组织周围，从而使治疗更具针对性；只要转化细胞不被清除，转化的因不被抑制，基因表达的产物就可以持续发挥作用。,核酸类药物,从根本上解决了某些药物的生物原料 适应证不断延伸 技术含量高 加速疑难病症新药物的开发,基因工程药物的特点,确定研制基因工程药物的技术路线 基本技术路线1：获得具有预防和治疗作用的蛋白质的基因 组入表达载体 受体细胞高效表达 动物试验 临床试验 申报新药证书 基本技术路线2：基因组未知
3、功能的人类基因全长cDNA群组入表达载体受体细胞瞬间表达功能初筛功能验证重组蛋白表达体内外药效分析临床前研究临床验证申报新药证书,二、研制基因工程药物的关键技术,优点：目的明确。缺点：发现新药的机率低，在人体内表达量较高的蛋白质才有较大可能被开发。,建立在庞大人类基因资源基础上的，具有巨大的开发潜力，缩短新药开发的时间，可大规模增加新药的数量。,宏观：在分子水平上，采用类似于工程设计的方法，按人类的需要产生不同的基因产物或定向的创造生物的新性状，使之稳定地遗传给子代。 微观：将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出
4、新性状。 供体、受体、载体 无性繁殖：称之为“克隆” 行使正常功能：称之为“表达”,基因工程的定义,在体外，将各种来源的DNA片段与载体DNA结合成一个重组载体；重组载体可转化或转染宿主细胞，并在宿主细胞内表达，产生特定的基因产物。 DNA片段：同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工合成的 载体DNA ：病毒、细菌质粒或噬菌体,生物化学角度：重组载体的操作,上游技术（upstream）-上游技术十分重要 重组子的构建 工程菌的构建及高效表达 下游技术（downstream）-下游技术更为重要 工程菌大规模发酵最佳参数的确定 新型生物反应器的研制 高效分离介质及装置的开发 分离纯化的优化控
5、制 生物反应器等一系列仪器、仪表的设计制造 超滤、反渗透技术的应用 我国现代生物技术与国际水平相比 上游技术落后35年 下游技术落后15年以上,基因工程技术,工程菌构建流程,选择载体 获得目的基因 目的基因与载体的重组 重组载体的转化 重组子的筛选与鉴定,基因工程上游技术基本过程,质粒（plasmid） 噬菌体（phage） 病毒（virus）,载体（vector）,载体的条件 分子小（ 10 Kb） 有限制酶酶切位点 可自主复制 有足够的copy数 带筛选的标志,限制性核酸内切酶 restriction endonuclease,一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶 特异核
6、苷酸序列 大多为 46 bp 回文对称（palindrome sequence） 5GAATTC 3 5GGATCC 3 3CTTAAG 5 3CCTAGG 5,宿主细胞,原核细胞：细菌、枯草杆菌 酵母：酿酒酵母，必赤酵母 植物细胞: 昆虫细胞： 哺乳动物细胞：,糖尿病到胰島素治療,“a melting down of flesh and limbs into urine. and that is the reason why the sickness has been called diabetes, as if it were a wine siphon, because liquid i
7、s not retained in the body“ (ca. 81-138A.D.) 1674 Thomas Willis 發現患者尿液有甜味，稱之“diabetes mellitus”. 1776 Matthew Dobson 取患者尿液殘餘物證實為糖。 Paul Langerhans (later half of 19th century) described islet cells-secrete glucose lowering substance 1922 Banting and Best discovered insulin.,T-J Wu,Discovery of insul
8、in,Banting & Best- extracted insulin from dogs & proved that it controls symptoms of diabetes in dogs 1921,1st patient to receive pancreatic extract-14-yr old Leonard Thompson. First patient to benefit from insulin saved from death.,胰島素 (Insulin)與諾貝爾獎,由於首次在人以胰島素成功地控制糖尿病1923 諾貝爾獎頒給Banting 與 Macleod 。
9、 1955 Frederick Sanger 闡明胰島素結構 (A鍊21 a.a. 與B 鍊 30 a.a.)，1958因此獲得諾貝爾獎。 1959 Solomon Beson 與 Rosalyn Yalow開發出免疫測定技術(immunoassay technique)， Yalow 也於1977 獲得諾貝爾獎。,Manufacture of Insulin,1923- started manufacturing insulin (Eli Lilly, Novo) Most developments in insulin therapy have originated from the la
10、boratories of Novo-Nordisk NPH insulin highly purified insulin monocomponent insulin semisynthetic insulin biosynthetic human insulin Currently Novo Nordisk manufactures human insulin from bakers yeast using rDNA technology；Eli Lilly produces human insulin using E. coli.,Improvement of insulin Quarl
11、ity,Problems with Early Preparations Crude high levels of non-insulin-like impurities Proinsulin, proinsulin intermediate, covalent insulin dimer Acidic pH 4-4.3 - pain during injection High incidence of allergic reactions Short duration of action (more no. of injections) Better Purification methods
12、 Conventional: isoelectric precipitation and recrystallization, Imp:10000-30000ppm Single peak: by gel-filtration chromatography, (Imp 300-3000ppm) Improved single peak : by ion-exchange chromatography, (50ppm) Highly purified : twice chromatographed insulin, (purified to 10ppm) Monocomponent : Imp1
13、ppm,History of insulin preparations,1922 : Isolation of insulin 1923 : Novo Nordisk starts production of insulin 1946 : NPH (Neutral Protamine Hagedorn) or Isophane insulin 1961 : First neutral soluble insulin: Actrapid 1964 : First premixed insulin: Mixtard 1973 : Monocomponent (MC) purity 1982 : H
14、uman Monocomponent HM 1985 : NovoPen with Penfill 1984 : Research on analogues,胰岛素是由51个氨基酸组成的双链多肽激素，一种可溶性酸性蛋白，分子量为5734道尔顿；每个胰岛素单体包括两条肽链（A、B链），A链含有21氨基酸；B链含有30氨基酸并分别由两个胱氨酸的二硫键连接，多聚体必须裂解成单体才可吸收；呈酸性，等电点为5.3。胰岛素受pH值、温度、离子强度的影响产生聚合和解聚。,Lispro由Lilly公司研发而成，是人胰岛素链上的第28 位的脯氨酸和第29 位的赖氨酸位置互换，其他的氨基酸序列和结构没有变化，以单
15、体的形式存在.,速效胰岛素-Lispro 赖脯胰岛素,1999年，Aspart在欧洲上市；2002年在我国上市，是由诺和诺德公司研发的速效胰岛素类似物，人胰岛素链28 位的脯氨酸被天冬氨酸取代，使该胰岛素类似物不易形成六聚体。与Lispro相比，Aspart的吸收速度更快，对餐后血糖的控制、降低糖化血红蛋白效果更好。这种药代动力学的差异可能与它们的等电点不同有关。Aspart对酸化溶液沉淀蛋白的耐受度较高,速效胰岛素 -Aspart门冬胰岛素,是Aventis 公司正在研发的一种新型快速作用的胰岛素类似物，链3 位的天冬酰胺被赖氨酸替代，而B链29位的赖氨酸则被谷氨酸取代。,速效胰岛素- Gl
16、ulisine赖谷胰岛素,由Aventis 公司研发的长效胰岛素类似物，2000 年在美国和欧洲上市，于2003 年在我国上市。和人胰岛素的区别在于A 链羧基端的第21 位天冬氨酸被甘氨酸替代，B链C末端加上2个精氨酸残基，。结构改变的结果是改变了胰岛素的等电点，由pH54升至67，使Glargine在生理pH条件下更难溶解、吸收更为缓慢，六聚体的结合更加稳定，无分泌峰值 .,长效胰岛素 -Glargine甘精胰岛素,由诺和诺德公司研制生产，结构上去除了人胰岛素B链29位赖氨酸E位以共价键结合一个N一16烷酸基的14碳游离脂肪酸，并去掉第30位的苏氨酸残基。与Glargine不同，Detemir 溶液在皮下不会形成沉淀，因此吸收速率恒定,长效胰岛素-Detemir地特胰岛素,基因诊断 gene diagnosis,内在因素（主要是遗传因素） 外在因素（环境因素） 外在因素+内在因
