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1、第六章 个别细胞和组织的培养,类型： 正常细胞培养 肿瘤细胞培养,第一节 正常细胞培养,正常细胞，在体外培养时都不易生长，建立细胞系更难。 正常细胞难培养的原因是它们是分化的细胞，对体外生存条件要求严格. 但只要一切条件适当仍有培养成功可能。,一、上皮细胞类培养,上皮细胞可来源于外、内、中三个胚层； 培养中只有源于外和内胚层的细胞能反映出上皮细胞的特征，细胞呈膜状生长的特点。,上皮细胞培养有三个难点： 需求特殊底物，如在底物上涂有胶原底层则利于细胞生长； 需求特殊培养基； 与上皮细胞相邻的成纤维细胞常与上皮细胞同时混杂生长，并常压过上皮细胞。 纯化和延长上皮细胞生存期是上皮细胞培养的关键之一。
2、,(一)表皮细胞培养 1特点： 在有胶原的底物上易生长； 把人或小鼠表皮细胞培养在以3T3 细胞为饲养层(用射线照射后)上时，细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。 降低pH、Ca2+的含量和温度等，均利于表皮细胞生长。 向培养基中加氢化可的松(10 g/m1)、10-6M的异丙基肾上腺素(Isoproterenol) 和10 ng/m1 促表皮生长因子(EGF) 能促表皮细胞生长。,【饲细胞】饲细胞(Feeder Cells)也称滋养细胞，是一层经过射线照射或丝裂霉素伤害处理的、用作克隆细胞附着底物的细胞层。 饲细胞作用： 有同化营养液的能力。 饲细胞能促克隆细胞的生长，利于克隆的形成。克隆
3、形成后饲细胞渐死亡，换液时清除。,饲细胞的制备： (1)取原代培养的人或动物胚胎成纤维细胞，90% 汇合时制成细胞悬液，再按103 细胞/毫升重新接种培养； (2)在细胞半汇合时，准备0.25g/ml 的丝裂霉素，按2ug/105 细胞的量加入到培养瓶中过夜；或用射线单次照射，剂量3050 戈瑞(Gy)； (3)细胞经上述处理后，Hanks 液漂洗两次、更换培养液、再培养24 小时，胰蛋白酶消化细胞制成悬液，按5104/ml接种入新培养基中； (4)48 小时后，即可用于细胞克隆之用。,2表皮细胞培养程序： (1) 取材：取外科植皮或手术残余皮肤小块，以角化层薄者为佳，早产流产儿皮肤更好，切成
4、0.5 1cm2小块； (2) EDTA 处理：先置入0.02 EDTA 中室温置5 分钟。 (3) 冷消化：换入0.25% 胰蛋白酶中，置4过夜； (4) 分离：取出皮块，用血管钳或镊子把表皮与真皮层分开；,(5) 温消化：取出表皮单独处理；用剪刀剪成更小的块后，置入新的0.25胰蛋白酶中，37再消化30 60 分钟； (6)制细胞悬液：用吸管轻轻反复吹打，使成细胞悬液； (7) 加培养液：通过80 目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸上清，直接加入Eagle 液和20小牛血清. (8)培养：接种入碟皿中，CO2 温箱培养。,注意事项：冷消化目的在于使表皮和真皮结合松散；如冷消化后分离下来的表皮
5、膜自身也已松散，此时亦可直接置入PBS 中用吸管吹打制备细胞悬液；不再经过第二次消化。,(二) 胃上皮细胞培养,适于胃上皮细胞生长的条件是： 胶原酶和透明质酸酶消化法并用消化细胞； 应用胶原底物培养； 制备含有特定成分的培养基；,培养程序： (1) 取材：取胃溃疡或胃癌手术切除胃标本远端非病变区粘膜少许； (2) 清洗：用含庆大霉素(400g/m1)和两性霉素(2g/m1 的Hanks)液漂洗后，用钝器剥离下粘膜，剪成1mm大小； (3) 消化：在I 型胶原酶和透明质酸酶中，于37中消化80 分钟； (4) 离心：收集细胞悬液，800 转/分离心后，Hanks 液漂洗两次；,(5) 接种：末次
6、离心后加入含有1 2胎牛血清的完全培养基，接种入不同孔数的培养板中；接种量依不同实验目的而定。 细胞接种后一般在16 小时内贴壁，细胞呈多角形，成岛状或片状生长，以后逐渐联接成片。初代培养可维持2 3 周，第一周末达高峰，最后逐渐衰退剥落。,(三) 肝细胞培养,肝脏具有取材方便和易于生长的优点，能获得典型上皮细胞培养。 1初代组织块培养： 肝组织做组织块培养效果很好。取新鲜肝脏，先剥除被膜和血管等纤维成分，用刀或剪刀把肝剪成1mm3 左右的小块，采用贴壁培养法。肝组织易于贴壁，生长力好，一般次日即可出现生长晕。,2初代消化法培养： (1) 把肝组织切成2 4 立方毫米的小块，用不合钙镁的BSS
7、 液洗两次； (2) 移入1:1 的0.1胰蛋白酶和0.1胶原酶(都用无钙镁BSS 配制) 中，4冷消化10 12 小时后，通过250 微米和64 微米尼龙网或不锈钢纱网滤过(用纱布滤过亦可)； (3) 收集细胞、BSS 液洗1 2 次、计数、接种培养；,3肝脏灌流法： 需用全肝，以较小动物如小鼠和大鼠为好。 (1) 无菌解剖动物，取出肝脏，先用BSS 洗除血污； (2) 取5ml 注射器一支，吸取消化液后，把注射器头轻轻插入肝管中，用线绳结扎牢固，以防消化液漏出，轻轻把消化液注入胆管系统，并不时轻柔压肝脏，以便消化液进入肝小叶中； 消化液在肝内停留20 30 分后，在吸出消化液的同时并轻柔压
8、肝脏，以使肝细胞脱落和消化液吸出；,(3) 待吸净消化液后，注入离心管中，低速离心分离，用RPMI 1640 培养基培养(较其它培养基为好)，能获得较纯的肝上皮细胞和获较好的效果。,(四) 内皮细胞培养,应用材料： 人脐带脐静脉、动物大动脉等， 用灌流消化法获取细胞最为简便。,(1)取产后的新鲜脐带；如不立即培养可保存于4中，但不宜超过12 小时；无菌剪取长10 15 厘米一段。 其它如胚胎和幼体动物的大血管，亦可用于培养； (2) 先用三通注射器吸温PBS 液注入脐带的脐静脉中，洗除残血；注入口处宜用线绳结扎，以防液体返流；,(3) 用血管钳夹紧脐带一端，从另端向脐静脉中徐徐注入最终浓度为0
9、.1的胶原酶，待末端出现液体后结扎之，令充满血管，注入口亦应结扎，以防液体返流，消化3 10 分钟； (4) 吸出含有内皮细胞的消化液，注入离心管中；为获取更多细胞，可再注入温PBS 冲洗2 3 次彻底清除干净残余细胞，一并注入离心管中离心； (5) 吸除上清，加1640 培养液，制成细胞悬液，接种入瓶皿中培养，顺利时2 3 天内细胞即可长成单层。,人脐带易于获得，培养效果好；细胞生长后，一般传6 7 代后即衰退，难以长期维持。用兔血管内皮细胞培养较好，可传10 30 代； 不同部位血管内皮细胞生物学性状不同，对各种作用因素反应亦有很大差别。,(五) 毛细血管内皮细胞培养,毛细血管细小，结构简
10、单，内皮细胞外有较多的结缔组织，进行分离培养有很大困难。 近年毛细血管培养已获成功； 利用人的小儿包皮、人脾脏、牛肾上腺、癌组织(如卵巢癌) 等均可；,1材料： 肿瘤条件培养基制备 (1) 取C3H 小鼠的S-180 实体肉瘤组织； (2) 胰蛋白酶消化，Dulbecco 改良Eagle 氏培养液15m1 (含10小牛血清) 种到培养瓶中培养；,(3) 在细胞生长接近完全汇合时，收集培养液制成条件培养基；再用含10小牛血清的新培养液后，也每隔两天收集一次，可获多量条件培养基； (4) 4000 转分离心后，再通过0.22m 微孔滤膜滤过，-20冻存备用(临用前融解)。 凝胶底层制备 (1) 取
11、60 mm Falcon 产培养皿，加1% Difco 产明胶(用不合钙和镁的Hanks 液配制)，铺盖瓶底，形成薄层； (2) 置4过夜；用前再用少许培养液冲洗一次。,2初代培养 (1) 取材：取新鲜牛肾上腺数个，先用Hanks 液洗除血污； (2) 消化：剥除被膜，分离出皮质，切成l mm3 小块，加0.5胶原酶室温中消化1 小时；每隔10 分钟用吸管吹打悬液令消化充分； (3)过滤：通过不锈钢纱网滤过，网眼要求只允许能通过小于110 微米长的毛细血管小段； (4)离心：650 rpm，4，离心7 分钟后，弃掉上清胶原酶；,(5)再离心：沉淀物用培养液重悬并离心，再重悬，再离心，共两次；
12、(6) 制细胞悬液：末次沉淀物仍用含10小牛血清的Dulbecco 改良Eag1e 氏培养液重悬后，稍吹打； (7)接种：接种入铺有明胶底层的培养皿中，37培养；在培养头1 3 小时中，毛细血管小段和内皮细胞最先贴附于底物上，而肾上腺细胞和成纤维细胞却仍在培养液中漂浮； (8)换液：吸除培养液，再加入肿瘤条件培养液；每两天换液一次。毛细血管小段一般成自1 4 个内皮细胞， 以后每个小段在底物上慢慢展成特殊形态的细胞岛，能持续2 5 天。,3毛细血管内皮细胞分离培养： (1) 初代培养2 3 天后，镜下确认几个毛细血管内皮细胞岛，在培养皿背面，用不脱色笔划圈圈起； (2) 镜下检查，如圈内残有非
13、内皮细胞时，可用显微细针在倒置显微镜下挑除；用细胞解剖器也可，宜在净化台无菌气流中、打开培养皿盖进行，但时间不宜过长(15 20 分钟)；圈外非内皮细胞可用无菌胶刮刮除；,(3) 用培养液漂洗两次，以去除漂浮细胞； (4) 剩余内皮细胞岛如小(5 20 个细胞) 而少时，生长增殖常变得缓慢或完全不生长，此时需加入3T3等饲细胞；饲细胞接种量为4000 细胞cm2； (5) 当内皮细胞充满所有饲细胞空间后，用胰蛋白酶消化、离心、加入肿瘤条件培养基； (6) 接种入明胶底物皿中继续培养(饲细胞死亡被淘汰)，细胞增殖生长汇合后，按1:5 传代。,二、结缔组织类细胞培养,(一) 成纤维细胞培养 包括人
14、在内的各种成纤维细胞都很容易培养，也是其它组织培养时的副产物，极易获得。 用人或动物胚体为好；动物可用小鼠或鸡胚，去头和内脏，剪成小碎块后，用胰蛋白酶消化法培养；如为人胚，可取皮肤培养。幼儿包皮是培养成纤维细胞的很好对象。,小鼠成纤维细胞培养条件,12.514.5d胎龄的小鼠胎儿分离效果最好； 最佳培养基为DMEM添加15%小牛血清； 第3代细胞增殖最旺盛； 室温条件下，0.125%胰蛋白酶消化时间以810min为宜。 在培养ES细胞时，应选择第35代的小鼠成纤维细胞作为饲养层细胞。,小鼠成纤维细胞； 细胞来源：swiss小鼠胚胎,(二) 巨噬细胞培养 巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细
15、胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。 巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。但属不繁殖型细胞群，难以长期生存，好的条件下仅能生活2 3周，因之多用作初代培养。 巨噬细胞也能建成无限细胞系；大多来自小鼠，如P388D-1、J774A1、RAW309、Cr. 1 等。,1培养技术要点： 来源和取材 巨噬细胞可来源于人胸水、腹水、血和透析液等材料。 实验多从动物血液、肺、脾和胸腹腔获取，其中以从动物腹腔取材最常用。用40g 的PHA 注入腹腔中，能产生6 8106 个细胞，而且无刺激性，效果较好。,2培养方法： 培养巨噬细胞可用各种方法和各种来源获取细胞，其中以小鼠腹腔取材法最为实用。人的材
16、料除来源不同外，培养方法大同小异。 程序 (1) 实验前三天，向每只小鼠腹腔内注入无菌硫基乙酸肉汤1ml (勿注入肠内)； (2) 引颈杀死动物；手提鼠尾将全鼠浸入70酒精中3 5 秒； (3) 置动物于解剖台上，用针头固定四肢，双手持镊撕开皮肤拉向两侧，暴露出腹膜，但勿伤及腹膜壁； (4) 再用70酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10ml Eag1e 液注入腹腔中，同时从两侧用手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动；,(5) 用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针头下吸取入针管内； (6) 小心拔出针头，把液体注入离心管中， (4)离心10 分钟后，去上清，加10 ml Eagle 培养基； (7) 计数细胞，每只小鼠可产生20 30106 细胞，其中90为巨噬细胞； (8) 为获取3105 个贴附细胞平方厘米，需接种2.5106m1；
