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1、Role of the Phosphatase PTEN in Early Vascular Remodeling,磷酸酶PTEN在早期血管重建中的作用,发表日期：2013年4月 杂志：PLOS ONE IF：3.534,研究背景及目的,磷酸酶PTEN是PI3K（磷脂酰肌醇-3-羟激酶）蛋白激酶B（Akt）信号通路的一种重要的生理学抑制剂，在过去的研究中，我们致力于研究在体内和体外情况下PTEN在血管急性损伤后VSMC凋亡方面的作用。然而，PTEN在血管成形术诱导的血管损伤的早期阶段的作用尚不明了。 为了明确该作用机制，我们设计该实验以探究磷酸酶PTEN在早期血管重塑中的作用。,技术路线,1.
2、体内(颈动脉损伤模型构建),2.体外：,成年Wistar大鼠（300g),颈总动脉分离,未处理（对照）,球囊损伤,12h后,PTEN表达量检测,取材（HcASMC）,细胞培养至第六代,干预 24h,转染,共转染PTEN/活化 的Akt突变体,血清,不同生长因子,周期性拉伸装置,H2O2,WT-PTEN质粒,SiRNA,敲出PTEN基因,凋亡VSMC数量 检测、Akt磷酸化 检测,VSMC凋亡数量检测,3.汇总数据、统计分析、得出结论,PTEN表达量检测,实验结果报告：图1A-D,为了探究血管受损后PTEN的表达及细胞凋亡情况，研究人员对实验大鼠颈动脉进行球囊损伤，12小时后，免疫组化检测各项指
3、标如上图： PTEN (green), apoptotic smooth muscle cells (TUNEL staining,red) and nuclei (DAPI, blue） 由图可知：球扩后损伤较严重的区域PTEN表达量较多，正常细胞数量少、凋亡细胞数量密集（图上半部分）,实验结果报告：图1E-F,western blot：using a specific PTEN antibody,微管蛋白,不同时间点PTEN相对表达量 densitometric analysis of immunoblots,对经/未经球扩后的标本裂解后通过免疫 沉淀反应进行PTEN活性检测： Immun
4、oprecipitations employing an IgG iso-antibody and without addition of any antibodies served as controls,由图可知：在大鼠颈动脉受损后12H内，PTEN的表达具有时间依赖性（递增） 与对照组相比，其活性明显高于未受损的大鼠颈动脉标本。,时间依赖性？,实验结果报告：图4A-C,A:Protein expression was determined by western blotting. Detection of Cdk4 served as a loading control. SMCtran
5、sfected with siRNA targeting PTEN or a scrambled control were incubated in basal medium in the absence (B) or presence of H2O2 (C). SMC were transfected as follows: non transfected(NT); mock transfected (without siRNA, but with lipid carrier); transfected with a non-targeting (scrambled) siRNA (Cont
6、rol siRNA); transfected with a targeting siRNA against PTEN (PTEN siRNA).,由图可知：与对照组相比，经siRNA敲出PTEN 基因之后，VSMC的PTEN表达量明显减少，凋 亡的SMC数量亦显著减少。,敲出PTEN基因后PTEN的表达及凋亡细胞数量变化,实验结果报告：图5A-C,A：Akt磷酸化检测（western blot） An antibody against total Akt （Pan Akt）was used as control. B: PI3-K-inhibitor Ly294002 (50 nM) was
7、 supplemented to the medium for not-transfected cells. HcASMC weretransfected as follows: non transfected (NT); transfected with a plasmid coding for GFP (pGFP); transfected with an empty plasmid withoutPTEN-cDNA (pControl); transfected with a plasmid coding for PTEN(pPTEN); mock trans -fected (with
8、out plasmid, but with transfection reagent). PTEN- and Akt co-overexpression reverses PTENs proapoptotic effect (C). 注： GFP（绿色荧光蛋白）,由图可知：与对照组相比，转染了PTEN质 粒的HcASMC其Akt磷酸化明显减弱；在未 转染组中加入PI3K抑制剂（Ly294002）之 后Akt磷酸化也明显减弱；当共转染了PTEN 质粒和活化的Akt之后可以部分翻转SMC凋亡。,为了探究PTEN与Akt磷酸化及细胞凋亡的关系，进行如下实验：,实验结果报告：图6A-B,A：生长培养基
9、（FCS）培养条件下 SMC增殖测定： PTEN overexpression attenuates serum Induced HcASMC proliferation (A). HcASMC transfected with a plasmid carrying WT-PTEN or a control vector carrying GFP alone were incubated either in basal medium or growth medium in the presence of BrdU. B:基础/生长培养基培养条件下 SMC增殖测定： HcASMC were tr
10、ansfected as following: transfected with a non-targeting (scrambled) siRNA (Control siRNA); transfected with a targeting siRNA against PTEN (PTEN siRNA).,由图可知：与对照组相比，转染了WT-PTEN 质粒后SMC增殖明显减少，敲出PTEN基因后 其增殖显著增多且在生长培养基上表现更显著。,探究PTEN对SMC增殖的影响：,实验结论,通过上述实验结果得出如下结论： 通过对依赖PI3-K/Akt的生存信号的干扰， 氧化应激诱导的PTEN上调在损伤的颈动脉VSMC中能增强血管平滑肌细胞对在损伤后早期阶段细胞凋亡刺激的敏感度，进而增加细胞的凋亡和细胞缺失。 简言之：血管损伤早期 PTEN上调 Akt磷酸化被抑制 细胞凋亡增多（增殖受抑）影响血管重塑,谢谢大家！,
