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1、分子肿瘤学 第七节 端粒、端粒酶与肿瘤,细胞是有寿命的。细胞学家Hayflick发现，培养人体的成纤维细胞，在营养充分供给的情况下，细胞分裂到50代左右就停止活动了，真正地进入衰老期，这一发现似乎告诉人们在细胞内有一口衰老钟或细胞分裂钟（mitotic clock)，这限定了细胞分裂的次数，也就限定了生物的寿命。 肿瘤细胞为什么具有永生的特性，它为什么可以不受限制的增殖？,研究显示染色体端粒（telomere） 、端粒酶（telomerase）与动物及人类的衰老、恶性肿瘤发生有高度相关性，成为发育生物学、分子肿瘤学等众多学科关注的焦点。人们期望能从中寻找出抗细胞衰老和治疗肿瘤的新途径。,端粒（
2、telomere）是真核生物染色体的天然末端，是细胞必需的遗传组分，因为它能够补偿染色体末端遗传信息的丢失。 早在1938年Muler用X射线处理果蝇，观察和分析因射线辐射引起的染色体重组的频率和类型时，发现染色体末端很少有缺失与倒位现象发生，便推断在染色体的两端一定存在一种特殊的结构并将它称之为端粒。,一、端粒、端粒酶的发现与染色体 的末端复制机制,在复制过程中，染色体末端的碱基对会缓慢地丢失，随着每一次的细胞分裂，染色体末端将丢失50200个端粒核苷酸，所以在连续分裂中，染色体产生进行性缩短，致使末端功能丧失和染色体不稳定，最终导致细胞衰老和死亡。 Watton在1972年提出了染色体末端
3、复制问题。,自然界中不同的生物有着各自巧妙的“策略”来解决DNA末端复制的难题。 原核生物有的将自已的DNA环化，新链的3-OH端继续向前延伸，这样一来便可补上RNA引物被消除后所留下的空缺。 有的通过形成多连体来达到完全复制。,一些具线性DNA的病毒，在长期的进化过程中，也恰当地选择了自已的末端复制策略。 如细小病毒（pariovirns）在单股DNA末端有一个正向的反向的重复序列，这一回文片段能在末端形成发卡形结构，使得合成新链折回补齐5端缺失。 腺病毒则有一种特殊的蛋白质与5端共价连接，并可作为腺病毒DNA复制的起始引物。,真核生物的染色体 DNA末端复制,1985年Blackburn实
4、验室在四膜虫中发现并纯化了一种由RNA和蛋白质组成的核糖核酸蛋白酶， 它能以自身的RNA为模板， 通过另一组分即依赖于RNA的DNA多聚酶的活性在染色体末端添加端粒重复顺序， 当合成完毕时，该酶向远处易位，再继续合成新的重复序列 延长的末端可以形成回文结构，使得合成新链折回补齐5端缺失，达到末端的完全复制，这就是真核生物的末端复制机制。 这种酶被称为端粒酶。,二.端粒的结构、功能与 长度调节机制,1、端粒的结构 端粒由规则或不规则的双链重复序列和最末端的一条富含G的单链重复序列及端粒结合蛋白组成。 端粒结合蛋白分为两类： 端粒单链结合蛋白和端粒双链结合蛋白。 前者在端粒末端提供帽状结构以稳定端
5、粒； 后者可能直接参与端粒长度平衡的维持，是端粒延伸的负调节因子。 对于一个特定的真核生物物种，它一定具有其特征性的端粒DNA序列和平均长度。研究结果表明，人类的端粒序列为TTAGGGn，约520kb。,2、端粒的功能,端粒的功能主要在于维持染色体的稳定性，此外，还参与核中的一系列活动。 如：染色体定位，转录抑制，异染色质形成，起细胞有丝分裂钟的作用，介导染色体复制、引导减数分裂时的同源染色体配对等。,3、端粒长度的调节机制,改变端粒结构会导致端粒酶活性失常，从而控制端粒的长度 而DNA的不完全复制、端粒的加工和端粒的重组，则会引起端粒的缩短,端粒的延伸与无限增殖化细胞端粒长度维持机制有关：
6、端粒酶阳性途径（telomerase-positive pathway），这类细胞端粒酶呈阳性，端粒短。 端粒酶阴性途径（telomerase-negative pathway），这类细胞端粒酶阴性，其端粒并不缩短。,三.端粒酶的结构、功能及 活性调控与检测,1、端粒酶的结构与功能 端粒酶是一种自身携带模板的反转录酶，在结构上是一种核糖核蛋白（nuclear ribonuclear protein,RNP)复合物，由 RNA和蛋白质亚基组成。 端粒酶的RNA 是合成端粒DNA的模板，人端粒酶RNA组分基因于1995年克隆，命名为hTR基因定位于三号染色体，约含450个碱基，包含5(CUAACC
7、CUAAC)3具11个碱基的模板序列，每次与1.5个TTAGGG互补而特异地合成人染色体端粒的DNA。 hTR基因在所有体细胞中都有表达，因而hTR的表达不能说明端粒酶活性。,其主要功能在于合成染色体端粒的重复序列，以维持端粒长度的稳定性，端粒酶也能使断裂染色体在原位形成端粒。,2、端粒酶的活性、检测与调控,端粒酶的活性： 不同的细胞，同一细胞的不同状态及某些物质的协同作用都可影响到端粒酶的活性。 对人体正常组织、多种良性病变及恶性肿瘤组织端粒酶活性进行检测，发现细胞分裂能力较强，分裂较快的组织端粒酶活性较高。 胎儿时期的端粒酶有较高的活性，但在出生后不久，除生殖细胞和干细胞等少数细胞显弱端粒
8、酶活性外，端粒酶多处于失活状态。 绝大多数恶性肿瘤组织均显示明显的端粒酶活性。,端粒酶活性的检测： 目前常用的检测方法有：同位素法、染色法、荧光法、ELISA法，也有报道用原位杂交方法检测石蜡标本的端粒酶基因表达获得与生化活性测定相一致的结果。 端粒重复序列扩增法（telomere repeat amplification protocol,TRAP)是将端粒延伸与PCR结合起来的方法，在此基础上又发展了TRAP-ELISA法等,端粒酶活性的调控：,端粒酶活性的内在调节 端粒酶在正常人体细胞的失活与在恶性肿瘤细胞中的高表达，说明体内端粒酶调控机制的存在 端粒重复结合因子（telomeric r
9、epeat binding factor,TRF)1和2是与端粒特异结合的蛋白质，其中TRF1是端粒长度的负向调控因子，其通过阻碍端粒酶与端粒的结合而发挥作用，而TRF2是端粒的保护因子。 端锚酶（tankyrase,TRF1-interactin)是一种DNA核糖聚合酶，可与TRF1结合，把与端粒结合的TRF1从端粒上移开，从而使端粒酶发挥作用 端粒酶的活性调控还与细胞周期、细胞分化进程，细胞中蛋白磷酸化反应、凋亡调控基因如bcl-2、c-myc等的调控有关。雌、孕激素的水平的变化也参与了调节。人3号染色体上可能存在端粒酶的抑制基因，当将人3号染色体导入肾癌细胞株，则出现细胞端粒酶活性丧失，
10、细胞失去无限制生长能力。,端粒酶活性的外在调节 细胞中加入端粒酶RNA组份的反义寡核苷酸，使端粒酶的活性受到抑制； 改变DNA的二级结构或在细胞中加入阳离子卟啉，妨碍端粒酶与端粒结合，从而间接抑制端粒酶活性； 使用蛋白激酶(PKC)抑制剂抑制端粒酶的活性 ； 通过破坏端粒酶的DNA锚着区，抑制端粒酶活性。,四.端粒、端粒酶与衰老的关系,人类细胞内端粒酶活性的缺失将导致端粒缩短，这种缩短使得端粒最终成为不能被细胞识别的末端。但这并不是说端粒不存在了，而是说端粒缩短到了一个“关键长度”，端粒一旦短于此长度，就很有可能导致染色体双链的断裂，并激活细胞自身的检验系统，从而使细胞进入死亡危机状态。,随着
11、端粒的进一步丢失，将会发生染色体重排、 双着丝粒染色体和非整倍染色体的形成等错误， 这将导致进一步的危机产生。,如果细胞试图要维持其正常的分裂，那么就必须阻止端粒的进一步丢失，并且激活端粒酶。 因为只有这样细胞才能进行正常的染色体复制。因此，只有那些重新获得端粒酶活性的细胞才能继续生存下去。 对于那些无法激活端粒酶（即无法阻止端粒进一步丢失）的细胞将只能面临趋向衰老死亡的结果。,染色体DNA,端粒,端粒,（Kbp） 干细胞 种系细胞端粒酶呈阳性 正常体细胞端粒酶呈阴性 M1 =5-7 转化事件 M2 =2-4 永生化肿瘤细胞端粒酶呈阳性 Hyflick极限期（M1） 危机期（M2） 复 制 年
12、 龄 端粒丢失与衰老关系模型,端粒限制性片断长度,“端粒-端粒酶”假说 基于端粒在细胞寿命中的作用，Harley提出了“端粒-端粒酶”假说。在细胞有丝分裂过程中，伴随着部分端粒序列的丢失，端粒长度缩短。当端粒缩短至一定长度时，可能触发某种信号，使细胞进入Hayflick限制或第一死亡期（M1期）(mortality stage 1)，此时细胞不再分裂并出现老化。如果细胞被病毒转化，或者某些抑癌基因的突变，细胞越过M1期继续分裂，端粒继续缩短，最终达到一个关键阈值，细胞进入M2期(mortality stage 2) 。这时，染色体可能出现异常形态，某些细胞因端粒太短丧失功能而导致细胞死亡，但极
13、少数细胞在此阶段激活了端粒酶，端粒功能得以恢复，染色体稳定，从而逃避M2危机，获得永生化。,1994年发现端粒酶仅在人卵巢细胞中表达，而在正常卵巢细胞中缺乏，才真正开始意识到端粒、端粒酶在肿瘤发生、发展中的重要性。,五.端粒酶的活性与恶性肿瘤,近年来，人们对人体恶性肿瘤组织端粒酶的活性进行检测，结果显示，绝大多数恶性肿瘤组织均显示明显的端粒酶活性，而在正常细胞株和癌旁组织标本中端粒酶几乎全部为阴性。这有力佐证了端粒酶的激活在维持细胞永生化、促进肿瘤的发生发展方面所具有的重要意义。 端粒端粒酶与细胞永生和肿瘤的关系可用M1/M2假说来解释，即细胞获得永生化必须克服两个死亡危机期。 端粒酶特异地表
14、达于各种肿瘤细胞，是大多数肿瘤细胞持续分裂所必需的，因此，端粒酶活性是诊断多数恶性肿瘤、判断愈后的良好指标。,端粒酶可作为肿瘤早期诊断的指标 人们试图抑制端粒酶活性来治疗肿瘤，它可能比目前所使用的化学疗法和基因疗法具更大的优势。 端粒酶抑制剂具有较高的特异性和较少的副作用，并具有广谱性。 传统疗法对早期肿瘤最有效，而端粒酶抑制剂可能对晚期和扩散肿瘤也有效。 端粒酶活性的监测可作为判断肿瘤肿瘤大小、恶性程度、淋巴结转移、肿瘤的分级及预后的重要指标 体外研究发现端粒酶活性与肿瘤细胞的分化呈负相关,端粒、端粒酶与肿瘤研究中遇到的几个基本问题：,在端粒酶阳性细胞中，端粒酶是肿瘤细胞形成的原因还是结果，在端粒酶阴性的肿瘤细胞中，通常具较长的端粒，其端粒又是怎么合成与维持的。 在有的永生细胞系中观察到端粒长度的突然大幅度增长或缩短，而端粒酶的活性却无变化。这些情况提示了还有不依赖端粒酶的端粒调节途径存在。 有些肿瘤对端粒酶抑制不敏感。并且即使有端粒酶活性的肿瘤细胞中，同样可能存在其它调节端粒酶长度的途径。 人体的生殖细胞以及具有干细胞的更新组织和免疫系统，也有端粒酶活性，端粒酶抑制剂对这些组织是否会产生不利影响？,
