免疫学诊断试剂中常用阻断剂应用指南

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1、www.MeridianLifeS 免疫学诊断试剂中常用的阻断剂 应用指南 2 | 阻断剂 - 应用指南 阻断剂应用于酶联免疫吸附试验和横向免疫层析试验以减少来自患者样本中 的蛋白质干扰并由此可能造成的假阳性，假阴性的错误检测结果。 选择最佳检测方法取决于预期测定方法的实际应用，待 分析的样品的种类，原材料的可用性，以及该检测方法 只是用于一个实验室的单个检测还是在多个实验室中由 不同技术人员操作。一般而言，免疫测定方法包括下列 类别： 酶联免疫吸附免疫夹心法检测抗原 - 用于定量检测靶 抗原/分析物 酶联免疫吸附俘获法检测抗体 - 用于筛查特定抗体 (如: IgG, IgM, IgA & I

2、gE) 酶联免疫吸附竞争法 - 用于检测存在于样品中抗原/分 析物，通常用于当小分子抗原或只有1-2个表位。 对于所有的方法有几个参数是决定检测方法性能的关 键：（1）固相材料的选择（2）抗体/抗原的选择（3） 阻断剂的选择。为了生产出高灵敏度和高特异性的试 剂，最关键的因素是选择具有与靶分子的高特异性结合 的抗体或抗原。然而，正确地使用阻断剂也有助于提高 检测的灵敏度和特异性。这些阻断剂的使用可以减少非 特异性结合以增加信噪比。 在免疫测试中非特异性结合可发生于（1）固相材 料和 非目标的蛋白质结合 （2）患者的样品中存在的内源性 抗体和检测试剂内抗体的结合。为了防止非特异性结 合，在固相材

3、料包被之后使用阻断缓冲剂中以封闭固相 材料上任何剩余未结合的位点。在准备检测样本的过程 中使用其他的阻断剂以防止内源性干扰抗体与检测试剂 组分抗体结合。 各类免疫技术的固相材料 单克隆抗体和多克隆抗体的性能上的关键差异 概述 理想的固体表面是既有高度的结合能力又不破坏包被的抗原或抗体的天然 蛋白质的构象。 材料结合能力结合类型 硝化棉高疏水，亲水 PVDF高疏水 尼龙高疏水 板材及管材 聚苯乙烯低疏水 聚乙烯醇低疏水 酶标板低共价，疏水，亲水 珠类 聚苯乙烯中度疏水 聚苯乙烯高共价，疏水，亲水 微粒高共价，疏水 通常，选择单抗作为初级抗体，以保证检测试剂的高特异性，而多抗则被选择作为二抗，这样

4、通过多点结合以达到信号的最大化。然而，任何其他的 组合均可采用。所有的候选抗体必须根据预期样本类型进行优化以选择出最佳的组合方案。 单克隆抗体 (单抗) 通常用小鼠或重组方法生产，这些抗体识别的 单一的抗原表位。 由于只有一个抗体分子与抗原结合，该结合是 高度特异性的，但可能缺乏灵敏性 多克隆抗体 (多抗) 用山羊，绵羊，鸡，兔等动物生产。 多克隆血清是多种特异抗体的混合。特异性抗体（多抗）的浓度通常为50-200g/毫升。 多抗能够识别任何一个特定抗原上的多个表位，这使得它们对于抗原决定簇的突变不太敏感。 当抗原的性质没有完全知晓的情况下多抗是十分有应用价值的。然而，它们的产量是受产生它的

5、动物的寿命限制的。 www.MeridianLifeS | 3 免疫诊断方法分类 这是一个灵敏感和稳定的方法。靶抗原加在两个抗体之间（捕获抗体和检测抗体）。捕获抗体被预先包被到固相 材料上然后加入含有抗原的样品。经过洗涤步骤以去除未结合的抗原，而后加入可直接和检测抗体结合的检测抗 体。捕获抗体和检测抗体必须结合到抗原的非重迭表位上。任何单克隆抗体或经亲和纯化的多克隆抗体均可以用 作捕获抗体或检测抗体。进而，被检测抗原可以与标记的检测抗体（直接检测）结合或与一组匹配的未标记的检 测抗体和标记的二抗（间接检测）来结合，从而达到检测的目的。 抗原直接包被在固相材料上。加入含有抗体的样本。使用标记的检

6、测抗体（直接检测）或一组匹配的未标记检测抗体 和标记二抗（间接检测）检测病人样本中的的抗体。直接检测法如图所示。 这是一个患者的目标分析物中的抗原和竞争抗原（抑制剂抗 原）之间的竞争性结合的过程。目标分析物特异性抗体特被 包被到固相材料上，患者样品中的抗原和标记的抑制剂抗原 一起与包被的抗体温育并且竞争结合位点。未结合的标记的 抑制剂抗原和分析物通过洗涤除去。样品中的分析物抗原越 多则越少的标记抑制剂抗原可以结合到抗体。由此产生的测 定信号则越弱。反之亦然。这种方法通常用于只有 1-2个表位 的小分子的抗原。 免疫夹心法检测抗原 免疫捕获法检测抗体 (IgG, IgM & IgA) 免疫竞争法

7、 直接法 IgG 检测 检测抗体 检测标记物 捕获抗体 抗原 间接法 IgM检测 检测抗体 二抗 捕获抗体 抗原 检测标记物 检测标记物 检测标记物 抗原 抗原 病人样本 IgG 抗体病人样本 IgM 抗体 检测抗体 检测抗体 直接法 检测标记物 捕获抗体 竞争抗原病人样本 理想封闭剂具有以下特征： 有效地阻断测定反应物非特异性结合到固体材料表 面 不影响已包被到固体材料表面的试剂有效成分 可以起到试剂有效成分在固相表面稳定剂（防止变 性）的作用 不与其它试剂有效成分发生交叉反应 不具有酶活性并由此可能与试剂中的底物反应而使 信号加强或降解试剂中的反应物 每个批号批间差小 酶联免疫吸附试验中不

8、使用封 闭缓冲液时 开发一种新的免疫测试方法，第一步就是优化抗原或捕 获抗体在固相材料上的包被条件以期最大限度地把有效 蛋白包被到固相材料表面。包被之后，固相材料表面任 何剩余的未占据的结合位点必须被封闭以防止非特异性 物质的结合。一个理想的封闭剂通常为蛋白质，因为它 能够有效地封闭固相材料表面疏水性和亲水性位点。此 外，它可以作为一种稳定剂用以防止蛋白在与固相材料 的表面反应时发生变性。封闭剂的用量和使用时间必须 根据每个检测方法进行优化。封闭剂的用量不足将导致 过高的背景信号以及减小的信噪比。而使用浓度过高的 封闭剂则可能掩盖抗体 - 抗原相互作用，从而也可引起信 噪比的减小。 患者样品中

9、的未结合的杂质，如蛋白质，干扰分子等和 测定标记物结合到固相材料表面并与特异性抗原 - 抗体 反应信号竞争从而引起的背景噪声和减少检测信号。 封闭缓冲液旨在饱固相材料上的开放位点从而防止未结 合的杂质与开放位点的非特异性结合。 固相的定量免疫学测定方法，如酶联免疫吸附，横向免疫层析，以及免疫印迹均 涉及抗体通过共价结合包被到固相材料的表面上这一过程。固相材料表面其他蛋 白质或生物分子的非特异性结合可以减少检测的特异性和灵敏度。由此而专门设 计的固相材料封闭剂是用以饱和固相材料的表面上未被抗体包被的结合位点以防 止其他物质的非特异性结合从而提高试剂的灵敏度。 联免疫吸附试验中使用封闭缓冲液时 检

10、测抗体 检测标记物 未结合的杂质 捕获抗体 抗原 检测抗体 检测标记物 捕获抗体 抗原 封闭缓冲 液 固相材料的封闭 4 | 阻断剂 - 应用指南 常规封闭流程 1. 在抗原抗体包被在固相基质上后，直接加封闭液到小孔，磁 珠，印迹膜或NC膜上。 2. 选择检测时封闭剂的最佳浓度，可以是1X或进一步稀释。 3. 优化最佳的孵育温度和时间来调节封闭剂的效果，提高温度 和增长时间都会增加封闭的效率，典型的条件为在25-30 下孵育30-120分钟。 4. 进行洗涤步骤。 注意事项：（除了加封闭液以外，每一步之间 的充分洗涤也很重要。可以减小残留试剂和膜 的非特异性结合，降低背景，增强信噪比，未 充分

11、洗涤会造成本底过高。经常用的技术是稀 释的封闭液中加上一些高纯度的去污剂。） 用于ELISA, PBS缓冲液 这是在PBS缓冲液（pH 7.4）中非哺乳动物干扰物封闭剂。它用于使用微孔板或其它固相材料的ELISA方法。包 被之后，它可以有效地封闭微孔板或膜上的未被包被的位点。从而提供提高信噪比。建议使用1倍浓度或进一步 稀释。 用于横向免疫层析, PBS缓冲液 这是在PBS缓冲液（pH7.40.2）中我们有自主知识产权的专有封闭剂。它用于使用膜或其它固相材料的横向免 疫层析系统。它可以降低非特异性结合并稳定包被蛋白从而提高检测信号。用于封闭非哺乳动物蛋白的干扰分 子。建议使用1倍浓度或进一步稀

12、释。 用于横向免疫层析, Tris缓冲液 这是在Tris缓冲液（pH 8.1）中的我们有自主知识产权的专有封闭剂。它用于使用膜或其它固相材料的横向免疫 层析系统。它可以降低非特异性结合并稳定包被蛋白从而提高检测信号。用于封闭非哺乳动物蛋白的干扰分 子。建议使用1倍浓度或进一步稀释。 用于免疫印记, PBS缓冲液 这是在PBS缓冲液（pH 7.4）中非哺乳动物干扰物封闭剂。它是经优化后用于超敏免疫印迹测定系统中的非哺 乳动物封闭试剂。该配方用于非哺乳动物蛋白以防止非特异性相互作用和提高检测的特异性。建议使用1倍浓度 或进一步稀释。 包被稳定剂和封闭缓冲液 专门配制的试剂旨在改善结合于固相的抗原/

13、蛋白质的稳定性和功能。应用于极不稳定的蛋白质或含少且不稳定 抗原/蛋白质。1：1稀释到的试剂中其他阻断剂的浓度。缓冲液的pH7.20.2。 牛血清白蛋白（BSA） 最常用的封闭剂，可用于各种用途包括ELISA，免疫印迹和免疫组化。 BSA作为封闭试剂对于使用蛋白敏感的抗 体，如磷酸化特异性抗体的方法尤其有效。在PBS缓冲液中（pH7）常用浓度为1到5之间。 J82100B J82300B J82310B J82200B J16430D A64801B 推荐使用的封闭剂 www.MeridianLifeS | 5 阻断试验中出现的干扰 真正的阳性结果 假阴性 干扰抗阻断捕获或检测抗体的结合位 点

14、。通常发生在夹心法和竞争法分析。 假阳性 干扰抗体在没有抗原的的情况下和 捕获抗体和检测抗体结合。通常只 发生在有夹心法测定。 检测抗体 捕获抗体 抗原 封闭缓冲液封闭缓冲液封闭缓冲液 干扰抗体 (异嗜性干扰) 免疫检测干扰是一类会引起检测结果假阳性或假阴性现象的泛指。潜在的干 扰因素包括内源性抗体或病人样本中的其它结合蛋白，多反应抗体，自身抗 体（嗜异性抗体）和人抗动物抗体。 在免疫检测时，干扰物可通过非特异性结合来干扰抗体和分析物之间的反应，一方面抑制目标分析物与检测抗体的 结合，产生假阴性，另一方面又可以在缺少目标分析物的情况下与捕获和检测抗体结合，从而产生假阳性。 容易受到干扰的检测包

15、括双抗体夹心抗原检测，竞争性 检测和IgM捕获检测。文献中报道过的典型的例子包括 对ToRCH，CEA，CA-125，CK-MB，LH，FSH，prola ctin，TSH，AFP，cardiac troponin I (cTnI)和hCG等 的检测。 常见的引起夹心抗原检测和竞争性检测偏差的类型主要 是异嗜性抗体（HA）的干扰，HA是一类结合力弱的天 然抗体，可与来自不同物种的免疫球蛋白反应，这些物 种包括小鼠，山羊，兔子，绵羊和鸡。在诊断检测 中，HA可以结合多种类型的无关抗原，从而干扰抗 原-抗体的特异性结合反应。 人抗小鼠抗体（HAMA）的干扰是HA干扰的一种类 型，它可以特异性的结合

16、小鼠抗体。因为小鼠单克隆在 免疫检测的商业诊断中应用非常广泛，所以HAHA的干 扰经常会遇到。例如人自身抗体类风湿因子（RF），可 以与人自身的免疫球蛋白（IG）结合，同时也可以与动 物免疫球蛋白交叉反应，可引起与HA/HAMA干扰类似 的RF干扰。通常同种型（Fc 区域）特异性的HA干扰比 异种型（Fab或结合位点）特异性的HA更普遍。 IgM捕获检测一般会受到两种类型的干扰，第一来自于 病人的高丰度的IgG抗体在固相时会与IgM竞争性的结 合抗原上的结合位点。因为人血清中IgG抗体含量非常 高，大约占血清中总抗体的75%，所以在竞争性结合抗 原的 结合位点时占据绝对优势。第二个干扰是IgM RF, 它可以与免疫球蛋白上的Fc片段互做产生假阳性结 果。RF在1-4%的人群中发现，而在75%的65岁以上的成 年病人中都有存在。 6 | 阻断剂 - 应用指南 夹心法免疫检测是指用两个抗体（单抗或者多抗）分别结合抗原或其它目标物 上的两个位