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1、1,第十一章 荧光分析法 （Fluorometry),2,第十一章 荧光分析法,荧光（萤光）：是指一种光致发光的冷光现象 （当某种物质经某种波长的入射光（紫外orX射线）照射，就会发光；停止光照后，有些物质甚至仍能看到发光，持续时间长达几个小时至十几小时）,1575年，西班牙医生N.Monardes发现。 1852年，Sir George Stokes对荧光产生的机理作了解释，并提出了“荧光”。 1867年，首次用于分析测定。 1928年，Jette和West提出第一台光电荧光计。 1952年，商品荧光分光光度计出现。,3,第十一章 荧光分析法,荧光分析法： 是根据物质的荧光谱线位置及强度进行
2、物 质鉴定和含量测定的方法。,优点：灵敏度高（比紫外-可见吸收高24个数量级） 选择性好（既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱） 检测限10-10g/mL,甚至10-12g/mL,缺点：试样量少（应用范围较窄）,4,第十一章 荧光分析法,5,第十一章 荧光分析法,第一节 荧光分析法的基本原理,第一节 荧光分析法的基本原理,一、分子荧光,（一） 荧光的产生,1. 分子的能级与跃迁,物质分子体系中存在着电子能级、振动能级和转动能级,室温时，多数分子处在电子基态最低振动能级（S0），当受到一定辐射能的作用时，就会发生能级之间的跃迁。,基态(S0)激发态(S1*、S2*、激发态振动能级)：吸收特
3、定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；,激发态基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；,（吸收）,（发射）,6,第十一章 荧光分析法,第一节 荧光分析法的基本原理,（一）荧光的产生,2. 电子激发态的多重性,第一、第二、电子激发单重态 S1* 、S2* ； 第一、第二、电子激发三重态 T1 、 T2 ；,大多数有机分子的基态处于单重态；,7,第十一章 荧光分析法,第一节 荧光分析法的基本原理,（一）荧光的产生,3. 荧光的产生,电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；,能量传递途径,振动弛豫,非辐射跃迁,辐射跃迁,延
4、迟荧光,磷光,荧光,外转移,内转移,系间跨越,激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大 荧光：10-710 -9 s,第一激发单重态的最低振动能级基态； 磷光：10-410s；第一激发三重态的最低振动能级基态；,9,第十一章 荧光分析法,第一节 荧光分析法的基本原理,（一）荧光的产生,3. 荧光的产生,辐射能量传递过程,荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级基态（ S1* S0跃迁），发射波长为 2的荧光； 10-710 -9 s 由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长； 2 2 1 磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级基态（ T1* S0跃迁
5、） 电子由S0进入T1的可能过程：（ S0 T1*禁阻跃迁） S0 激发振动弛豫内转移系间跨越振动弛豫 T1* 发光速度很慢： 10-4100 s 。 光照停止后，可持续一段时间。,10,第十一章 荧光分析法,第一节 荧光分析法的基本原理,（一）荧光的产生,3. 荧光的产生,非辐射能量传递过程,振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12 s。 内转换：当两个电子激发态之间的能量相差较小以致其振动能级有重叠时，受激分子由高电子能级以非辐射方式转移至低电子能级的过程。 外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射
6、跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。 系间跨越：处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的过程。,11,第十一章 荧光分析法,第一节 荧光分析法的基本原理,（二）荧光的激发光谱和发射光谱,荧光物质分子具有两个特征光谱：,1. 激发光谱： 2. 发射光谱： （荧光光谱）,固定测量波长（选最大发射波长），化合物发射的荧光强度与激发波长的关系曲线。,固定激发波长（选最大激发波长），化合物发射的荧光与发射波长的关系曲线,绘制方法：固定发射单色器在某一波长,以不同波长的入射光激发荧光物质,记录荧光强度（F)对（ex）的关系曲线,激发光谱,绘制方法：固定激发光的波长和强度,检测各种波长
7、下对应的荧光强度,记录荧光强度（F）对（em）的关系曲线,荧光光谱,12,蒽的激发光谱（吸收光谱）和发射光谱（荧光光谱）,激发光谱 Excitation Spectrum, 激发波长:ex,发射光谱 Emission Spectrum, 发射波长:em,13,荧光分析法测定血清中的镁,镁-Oxine的激发光谱和发射光谱,/,Oxine：8-羟基喹啉,14,第十一章 荧光分析法,第一节 荧光分析法的基本原理,（二）荧光的激发光谱和发射光谱,3. 激发光谱与发射光谱的关系,a. 斯托克位移（Stokes shift） 是荧光发射波长总是大于激发光波长的现象。 激发态分子通过内转换和振动弛豫过程迅速
8、达到S1*的最低振动能级，消耗了能量。 b.发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图 2 , 1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如 2 )。 c. 镜像规则 通常荧光发射光谱与它的激发光谱（与吸收光谱形状一样）成镜像对称关系。,15,第十一章 荧光分析法,第一节 荧光分析法的基本原理,（二）荧光的激发光谱和发射光谱,镜像规则的解释,激发光谱是物质分子由基态激发至第一电子激发态的各振动能层形成的。其形状决定于第一电子激发态中各振动能级的分布情况。荧光光谱是激发分子从第一电子激发态的最低振动能层
9、回到基态中各不同能层形成的。所以荧光光谱的形状决定于基态中各振动能级的分布情况。,16,第十一章 荧光分析法,第一节 荧光分析法的基本原理,（二）荧光的激发光谱和发射光谱,镜像规则的解释,基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；,基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也是。,17,S0,S1*,V=0,V=1,V=2,V=0,V=1,V=2,b0,b1,b2,c2,c1,c0,E2,E1,E2,E1,b0,c0,b1,b2,c1,c2,镜像关系解释示意,200,250,300,350,400,450,500,荧光激发光谱,荧光发射光谱,nm,蒽
10、的激发光谱和荧光光谱幻灯片 31,19,第十一章 荧光分析法,第一节 荧光分析法的基本原理,二、荧光与分子结构,分子产生荧光必须具备的条件, 具有强的紫外-可见吸收 具有一定的荧光量子产率,20,第十一章 荧光分析法,第一节 荧光分析法的基本原理,二、荧光与分子结构,（一）荧光量子产率 荧光效率,荧光量子产率又称荧光效率，是指激发态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发光的光子数之比，常用f表示,一般物质的f在01之间,荧光量子产率与物质吸收的能量以何种形式释放有关，若能量都以无辐射跃迁形式释放，外转换过程速度快，则不出现荧光发射。,21,第十一章 荧光分析法,第一节 荧光分析法的基本原理,二
11、、荧光与分子结构,（二）有机化合物分子结构与荧光的关系,1. 共轭效应 * 跃迁 芳香族化合物、五元杂环上取代苯基 共轭程度越大,荧光效率越大，波长长移,22,第十一章 荧光分析法,第一节 荧光分析法的基本原理,二、荧光与分子结构,（二）有机化合物分子结构与荧光的关系,1. 共轭效应 * 跃,苯 萘 蒽 ex 205nm 286nm 356nm em 278nm 321nm 404nm f 0.11 0.29 0.36,维生素A,ex327nm， em510nm,23,第十一章 荧光分析法,第一节 荧光分析法的基本原理,（二）有机化合物分子结构与荧光的关系,2. 刚性结构和共平面效应,酚酞(无
12、荧光),荧光黄,联二苯 = 0.2,芴 = 1.0,24,第十一章 荧光分析法,第一节 荧光分析法的基本原理,（二）有机化合物分子结构与荧光的关系,2. 刚性结构和共平面效应,8羟基喹啉(弱荧光),红色荧光,3,4-苯并芘,( 强荧光物质),25,第十一章 荧光分析法,第一节 荧光分析法的基本原理,（二）有机化合物分子结构与荧光的关系,3. 取代基的作用,给电子基增强荧光：增加分子电子的共轭程度 OH,OR,NH2,NHR,NR2,CN 吸电子基减弱荧光：减弱分子中电子的共轭程度 COOH,C=O,NO2,NN,Cl,Br,I 与体系作用小的取代基影响不明显： SO3R,NH3,SH,F,R。
13、,26,第十一章 荧光分析法,第一节 荧光分析法的基本原理,（二）有机化合物分子结构与荧光的关系,取代基之间若发生氢键，增强分子平面性和刚性会加强荧光:,3. 取代基的作用,27,第十一章 荧光分析法,第一节 荧光分析法的基本原理,三、影响荧光强度的外部因素,1. 温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加。 2. 溶剂的影响 除一般溶剂效应外，溶剂的极性、黏度、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化； 3. 溶液pH 对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；,28,第十一章 荧光分析法,第一节 荧光分析法的基本原理,三、影响荧光强度的外部因素,4. 荧光
14、熄灭剂,荧光熄灭又称荧光淬灭，是指荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子相互作用引起荧光强度降低的现象。引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂。 如果一个荧光物质在加入某种熄灭剂后，荧光强度的减弱和荧光熄灭剂的浓度呈线性关系，则可利用这一性质测定荧光熄灭剂的含量，该方法称为荧光熄灭法。,29,第十一章 荧光分析法,第一节 荧光分析法的基本原理,三、影响荧光强度的外部因素,5. 散色光,当一束平行单色光照射在液体样品上时，大部分光线透过溶液，小部分由于光子和物质分子相碰撞，使光子的运动方向发生改变而向不同角度散射，该光称为散射光,瑞利散射 光子与物质发生弹性碰撞，不发生能量 交换，仅是光子运动方向发生变
15、化。,拉曼散射 光子与物质发生非弹性碰撞，发生能量交 换，光子运动方向改变。其波长与荧光波 长接近，对荧光测定干扰更大。,消除方法：选择适当的激发波长可消除拉曼光的干扰,图 11-6,30,第十一章 荧光分析法,第一节 荧光分析法的基本原理,三、影响荧光强度的外部因素,5. 散色光,a：硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光 b：0.1mol/L硫酸溶液在不同波长下的拉曼散射光,选择320nm做激发波长,31,第十一章 荧光分析法,32,第十一章 荧光分析法,第二节 荧光定量分析方法,第二节 荧光定量分析方法,荧光 F,由于荧光物质是在吸收光能而被激发之后才发射荧光，So,溶液的荧光强度与该溶液中荧光物质吸收的程度以及荧光效率有关,33,第十一章 荧光分析法,第二节 荧光定量分析方法,第二节 荧光定量分析方法,一、荧光强度与物质浓度的关系,定量依据 荧光强度正比于被荧光物质吸收的光强度，F（I0-It） F=K(I0-It） K：常数，取决于荧光效率 （11-2） 根据朗伯-比尔定律：It=I010-Ecl （11-3） 将（11-3）代入（11-2）：F=KI0（1-10-Ecl）=KI0（1-e-2.3Ecl） 若c很小，当Ecl0.05时: F = 2.3KI0Ecl = K
