生物工艺学第四章生物工艺过程中的无菌技术

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1、生 物 工 艺 学,国家十一五规划教材生物工艺学（邱树毅主编）配套课件,目 录,第一章 绪论 第二章 工业微生物菌种选育、制备与保藏 第三章 工业培养基及其设计 第四章 生物工艺过程中的无菌技术 第五章 生物反应动力学 第六章 发酵过程原理 第七章 生物反应器及生物工艺过程的放大 第八章 生物反应过程参数检测与控制 第九章 生物产品分离及纯化技术 第十章 生物产品工艺学及应用,第四章 生物工艺过程中的无菌技术,4.1 生物反应过程中无菌的要求 4.2 工业常用无菌技术 4.2.1 干热灭菌 4.2.2 湿热灭菌 4.2.3 射线灭菌 4.2.4 化学药剂灭菌 4.2.5 过滤除菌 4.3 培养

2、基灭菌 4.3.1 湿热灭菌原理 4.3.2 分批灭菌 4.3.3 连续灭菌 4.4 空气除菌 4.4.1 空气除菌方法 4.4.2 空气除菌流程 4.5 设备及管道灭菌,采取措施对生产过程涉及到的原料、设备等进行灭菌处理，达到严格的纯种培养条件。通常工业上采取的主要措施是： (1)对培养基进行灭菌处理； (2)对好氧过程的空气进行灭菌处理； (3)对生物反应器(发酵罐)及其连接管道进行灭菌处理； (4)菌种为无污染的纯粹种子； (5)使生物反应器处于正压环境； (6)对培养过程中补料进行灭菌处理等。,4.1 生物反应过程中无菌的要求,4.2.1 干热灭菌,4.2 工业常用无菌技术,4.2.2

3、 湿热灭菌,4.2.3 射线灭菌,4.2.4 化学药剂灭菌,4.2.5 过滤除菌,干热灭菌时，微生物主要由于氧化作用而死亡。最常用的方法有以下两种： (1)灼烧法。常用于实验室接种针、勺、试管或三角瓶口和棉塞的灭菌，也用于工业发酵罐接种时的火环保护。 (2)烘箱热空气法。将物品放入烘箱内，然后升温至150170，维持12小时。经过烘箱热空气法可以达到彻底灭菌的目的。该法适用于玻璃、陶瓷和金属物品的灭菌。其优点是灭菌后物品干燥，缺点是操作所需时间长，易损坏物品，对液体样品不适用。,4.2.1 干热灭菌,利用饱和蒸汽进行灭菌的方法称为湿热灭菌。通常湿热灭菌条件为121，维持30min。 高压蒸汽灭

4、菌是实验室、发酵工业生产中最常用的灭菌方法。一般培养基、玻璃器皿、无菌水、缓冲液、金属用具等都可以采用此法灭菌。,4.2.2 湿热灭菌,射线灭菌是利用紫外线、高能电磁波或放射性物质产生的高能粒子进行灭菌的方法，其中以紫外线最常用。其杀菌作用主要是因为导致DNA胸腺嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体和胞嘧啶水合物，抑制DNA正常复制。此外，空气在紫外线辐射下产生的臭氧有一定杀菌作用。,4.2.3 射线灭菌,某些化学试剂能与微生物发生反应而具有杀菌作用。常用的化学药剂有酒精、甲醛、漂白粉(或次氯酸钠)、高锰酸钾、环氧乙烷、季铵盐等。由于化学药剂也会与培养基中的一些成分作用，且加入培养基后易残留在培养基内，所

5、以，化学药剂不能用于培养基的灭菌，一般应用于发酵工厂环境的消毒。,4.2.4 化学药剂灭菌,过滤除菌是利用过滤法阻留微生物以达到除菌的目的。此法仅适用于不耐高温的液体培养基组分和空气的过滤除菌。工业上常用过滤法大量制备无菌空气，供好氧微生物的液体深层发酵使用。,4.2.5 过滤除菌,4.3.1 湿热灭菌原理,4.3培养基灭菌,4.3.2 分批灭菌,4.3.3 连续灭菌,4.3.1.1 微生物热阻, 每种微生物都有一定的生长温度范围。当微生物处于生长温度的下限时，代谢作用几乎停止而处于休眠状态。当温度超过生长温度的上限时，微生物细胞中的蛋白质等大分子物质会发生不可逆变性，使微生物在很短的时间内死

6、亡，加热灭菌就是根据微生物的这一特性进行的。 一般微生物的营养细胞在60加热10min全部死亡，但细菌芽孢能耐受较高的温度，在100需要数分钟甚至数小时才能被杀灭。某些嗜热菌的芽孢在120下需30min甚至更长时间才能杀灭。所以，一般衡量灭菌彻底与否，是以能否杀灭芽孢细菌为标准。,4.3.1 湿热灭菌原理,致死温度：杀死微生物的极限温度称为。 致死时间：在致死温度下，杀死全部微生物所需要的时间称为。 在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短。由于不同种类微生物细胞及微生物细胞和微生物孢子对热的抵抗力不同，它们的致死温度和致死时间也有很大的差别。 热阻：微生物对热的抵抗力，即指微生物在某一特定条件

7、下(主要是温度)的致死时间。 相对热阻：指某一条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间之比。,在一定温度下，微生物受热致死遵循分子反应速率理论，微生物受热死亡的速率dN/dt在任何瞬间与残留的活菌数N成正比，这就是对数残留定律，其数学表达式为 式中：N残留活菌数，个； t受热时间，min； k比死亡速率常数，s-1。k也称灭菌速率常数，此常数大小与微生物种类及灭菌温度有关； dN/dt活菌数瞬时变化速率，即死亡速率。,4.3.1.2湿热灭菌的对数残留定律,若开始灭菌(t=0)时，培养基中活的微生物数为N0，将式上式积分后可得到 式中：N0开始灭菌时原有的活菌数，个； Nt经过t时间灭

8、菌后的残留菌数，个。 此式是计算灭菌的基本公式，从式中可知灭菌时间取决于污染程度(N0)、灭菌程度(残留菌数Nt)和k值。 亦可看出，如果要求完全彻底灭菌，即残留菌数Nt=0时，需要的灭菌时间为无穷大， 此式即无意义，事实上是不可能的。因此，工程上进行灭菌设计时，一般采用Nt=0.001，即在1000次灭菌中允许有一次染菌机会。,在实际过程中某些微生物受热死亡的速率是不符合对数残留规律的。将其N0/Nt对灭菌时间t在半对数坐标中标绘得到的残留曲线不是直线。呈现这种热死亡非对数动力学行为的主要是一些微生物芽孢。有关这一类热死亡动力学的行为，虽然可用多种模型来描述，但其中以Prokop和Hunph

9、ey所提出的“菌体循序死亡模型”最有代表性，其假设耐热性微生物芽孢的死亡不是突然的，而是渐变的，即耐热性芽孢(R型)先转变为对热敏感的中间态芽孢(S型)，然后转变成死亡的芽孢(D型)，这一过程可用下式表示 NR耐热性活芽孢数(R型)；NS敏感性活芽孢数(S型)； ND死亡的芽孢数(D型)；,4.3.1.3 湿热灭菌的非对数残留定律,根据对数残留定律，联立微分方程可得 式中：Nt任一时刻具有活力的芽孢数，即Nt = NS + NR； N0初始的活芽孢数； kR耐热性芽孢的比死亡速率，s-1； kS敏感性芽孢的比死亡速率，s-1。 在温度相同时，对数与非对数定律的灭菌时间t不同。,当培养基受热温度

10、从T1上升至T2时，微生物的比死亡速率常数k和培养基成分分解破坏的速率常数k变化情况为 对微生物的死亡情况而言 将上述两式相除并取对数后可得 培养基成分的破坏，同样也可得 两式相除得,4.3.1.4 灭菌温度和时间的选择,在生产中必须选择既能达到灭菌目的，又能使培养基成分破坏减少至最少的工艺条件。 微生物的受热死亡属于单分子反应，其灭菌速率常数k与温度之间的关系可用阿累尼乌斯方程表示： 式中：A阿累尼乌斯常数，s-1； R气体常数，8.314J/(molK)； T热力学温度，K； E微生物死亡活化能，J/mol 。 大部分培养基的破坏也可认为是一级分解反应，若其他条件不变，培养基成分分解速率常

11、数和温度的关系也可用阿累尼乌斯方程表示。,4.3.1.4 灭菌温度和时间的选择,灭菌温度和完全灭菌时间对维生素B1破坏量的比较,由于灭菌时杀死微生物的活化能大于培养基成分破坏的活化能E，因此随着温度的上升，微生物比死亡速率常数增加倍数要大于培养基成分破坏分解速率常数的增加倍数。也就是说，当灭菌温度升高时，微生物死亡速率大于培养基成分破坏的速率。根据这一理论，培养基灭菌一般选择高温快速灭菌法，换言之，为达到目的相同的灭菌效果，提高灭菌温度可以明显缩短灭菌时间，并可减少培养基因受热时间长而遭到破坏的损失。,不同成分的培养基其含菌量是不同的。培养基中微生物数量越多，达到无菌要求所需的灭菌时间也越长。

12、天然基质培养基，特别是营养丰富或变质的原料中含菌量远比化工原料的含菌量多，因此，灭菌时间要适当延长。含芽孢杆菌多的培养基，要适当提高灭菌温度并延长灭菌时间。,4.3.1.5 影响培养基灭菌的其他因素,培养基成分,培养基pH,培养基物理状态,泡沫,微生物数量,pH对微生物的耐热性影响很大，pH为6.08.0时微生物耐热能力最强，pH小于6.0时，H+易渗入微生物细胞内，改变细胞的生理反应促使其死亡。所以培养基pH愈低，灭菌所需时间愈短。,固体培养基的灭菌时间要比液体培养基的灭菌时间长，假如100时液体培养基的灭菌时间为1h，而固体培养基则需要23h才能达到同样的灭菌效果。其原因在于液体培养基灭菌

13、时，热的传递除了传导作用外还有对流作用，而固体培养基则只有传导作用而没有对流作用，另外液体培养基中水的传热系数要比有机固体物质大得多。,泡沫中的空气形成隔热层，使传热困难，对灭菌极为不利。因此对易产生泡沫的培养基进行灭菌时，可加入少量消泡剂。,油脂、糖类及一定浓度的蛋白质增加了微生物的耐热性，高浓度有机物会在细胞的周围形成一层薄膜，从而影响热的传入。所以灭菌温度应高些。 例如，大肠杆菌在水中加热到6065便死亡，在10%的糖液中，需70处理46min，而在30%的糖液中则需70处理30min。,4.3.2 分批灭菌,培养基的分批灭菌就是将配制好的培养基放在发酵罐或生物反应器中，通入蒸汽将培养基

14、和所用设备仪器进行灭菌的操作过程，也称为实罐灭菌，而若反应中没有物料，则称为空消，空消是对发酵罐设备及其周边连接管道进行灭菌处理。 优点：培养基的分批灭菌不需要专门的灭菌设备，对蒸汽要求低，投资少，设备简单，灭菌效果可靠。 缺点：在灭菌过程中蒸汽消耗量大，造成锅炉负荷波动大。 应用：分批灭菌是中、小型发酵罐经常采用的一种培养基灭菌方法。,分批灭菌在所用的发酵罐中进行。将培养基在配制罐中配好以后，用泵通过专用管道输入发酵罐中，然后用直接蒸汽或间接蒸汽加热到灭菌温度(一般121)在此温度维持一定时间，再冷却到发酵所需温度，完成灭菌过程。 分批灭菌过程包括升温、维持和冷却三个阶段，通常100以下的温

15、度对灭菌没有太多贡献，在实际过程中是忽略的，升温是指从100升到121的情况，而冷却是指121冷却到100时的情况，在这两个温度段，加热升温和冷却对灭菌是有贡献的。 为了使灭菌处理得到期望的结果，Deindoerfer引入了来测定灭菌度(N0/N) 。ln Deindoerfer还假设各阶段灭菌效果可以叠加，即 总加热维持冷却ln,4.3.2 分批灭菌,例：一万升培养基在发酵罐中于120分批灭菌，各阶段的时间分别为：升温从100120，37分钟，保持120，10分钟，从120冷却到100，13分钟，计算总。 解：由表45，从100120的值累加为7.25，由于实际升温过程为37分钟，而不是20

16、分钟，实际有更多的灭菌处理。则： 加热7.2513.41 同样，从120冷却到100，在20分钟时间内值为7.25，由于实际冷却时间为13分钟，灭菌过程实际更少，则 冷却7.254.71 保持阶段. kt，k1.47(120) 保持1.471014.7 所以，总加热维持冷却13.44.7114.732.82 一般来说，在培养基分批灭菌，使用Richards方法计算有大约5的偏差，其最大优点是计算简单，这样，在灭菌过程中可很快调整灭菌过程中出现的失误。,分批灭菌操作： 发酵罐上一般装有空气管道，取样用的取样管道，放料用的出料管道，接种管道，消泡管道，补料管道，调节pH用的酸碱管道以及控制培养温度用的降温水管道。降温水管是与夹套或蛇管连接，与发酵罐内部不相通。,4.3.2 分批灭菌,注意事项： 在进行培养基灭菌之前，通常应先把发酵罐的分空气过滤器灭菌