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1、第三章 DNA 复 制 (DNA Replication),Molecular Biology Course,教学要求,1. 理解DNA复制的半保留机制和半不连续复制 2. 掌握细菌DNA复制过程及有重要作用的酶和蛋白质 3. 掌握真核生物DNA复制的特点 4. 掌握DNA复制的类型,主要内容,第1节 DNA复制概述 第2节 细菌DNA的复制 第3节 真核生物DNA的复制,问 题,复制开始时亲本链是完全解开的吗？ 复制可以随机起始吗？ 复制是沿一个方向还是双向进行？ 复制是从53 还是3 5，或是双向进行的？ 复制过程中有哪些酶参与？,DNA replication,第1节 DNA复制概述,一
2、、半保留机制 二、复制子(Replicons)和复制方向 三、半不连续复制 (semi-discontinous replication ) 四、RNA引导 (RNA priming ),一、半保留机制,1. DNA复制 :亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分别以各单链 DNA分子为模板，聚合与自身碱基可以互补配对的游离的dNTP，合成出两条与亲代DNA分子完全相同的子代DNA分子的过程。,一、半保留机制,2.半保留复制：复制过程中各以双螺旋DNA的其中一条链为模板合成其互补链，新生的互补链与母链构成子代DNA分子 。,亲代DNA,子代,子代,半保留复制,新合成 的链,2、实验证据（1
3、958 Meselson 和Stahl）,Matthew Messelson Franklin Stahl,单林娜 制作,11,DNA replication,E. Coli DNA在15N-标记的营养液中生长多代，使DNA双链充分标记,万有引力,将15N-标记的E.Coli 加入14N 培养液中,细胞在14N中复制1次,细胞在14N中复制第2次,细胞在14N中复制第3次,DNA半保留复制的生物学意义： DNA的半保留复制表明DNA在代谢上的稳定性，保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代。,DNA replication,二、复制子(Replicons)和复制方向,1.复制子,原核生物（Proka
4、ryote）：单复制起点，即整个染色体只有一个复制单位,单林娜 制作,15,All prokaryotic chromosomes and many bacteriophage and viral DNA molecules are circles and comprise single replications. （单复制子）,真核生物（Eukaryote） : 多复制起点，即一个genome中有多个复制单位,2、复制方向（复制过程的顺序性）,复制叉（Replication fork）：复制时DNA分子中的叉形结构，是由解开的两条链和尚未松解开的双螺旋形成的，是复制有关的酶和蛋白质组装成复合
5、物和新链合成的部位。 replication bubbles(复制泡)：两个靠得很近的复制叉之间形成的空间。,origins of DNA replication (every 150 kb),replication bubble,daughter chromosomes,fusion of bubbles,bidirectional replication,Origins of DNA replication on mammalian chromosomes,5 3,3 5,5 3,3 5,3 5,5 3,Electron Microscopy of replicating DNA reve
6、als replicating bubbles.,单向复制,双向复制,（1）单双向复制取决于起点处有一个还是两个复制叉,单起点、单方向（原核）,多起点、单方向（真核）,多起点、双方向（真核）,（2） 复制的多模式,Bidirectional (双向复制) replication of a circular bacterial replicon,orign,termini,daughter DNA,A single termination site is roughly 180o opposite the unique origin,OK !,How ?,三、半不连续复制 (semi-disco
7、ntinous replication ),DNA聚合酶只能以53方向合成DNA， 事实上没有发现DNA能按35合成的证据,E.coli t-,2, 7, 15, 30,脉冲标记 dT-H3,0 KCN 杀死,D.S. DNA,S.S. DNA,密度梯度离心,测定 H3-T 放射强度,脉冲追踪,20 in dT-H3 30,正常培养基中数分钟,冈崎片段（Okazaki fragment）1968,D.S. DNA,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,前导链,后随链,Okazaki fragment,半不连续复制,leading strand（前导链）： DNA复制时，一股以3 5方
8、向的母链作为模板，指导新合成的链以5 3方向连续合成的链称为前导链。 （复制方向与解链方向一致）,lagging strand（后随链): DNA复制时，一股以5 3方向的母链作为模板，指导新合成的链沿5 3合成10002000(100-200)个核苷酸不连续的小片段的链称为随从链。 （复制方向与解链方向相反),岗崎片段（Okazaki）： DNA复制时，一股以5 3方向的母链作为模板，指导新合成的链沿5 3合成10002000(100-200)个核苷酸不连续的小片段称之为岗崎片段。 岗崎片段由DNA连接酶连成一条完整的新链。,半不连续复制： 在DNA复制过程中，亲代DNA分子中以3 5方向的
9、母链作为模板指导新的链以5 3 方向连续合成，另一股以5 3 为方向的母链则指导新合成的链以 5 3方向合成许多不连续的片段（岗崎片段） 这种复制方式称之为半不连续复制。,单林娜 制作,31,DNA replication,四 、RNA引导,The first few nucleotides(核苷酸) at the 5-end of Okazaki fragments are ribonucleotides(核糖核苷酸). Hence, DNA synthesis is primed by RNA that is then removed before fragments are joined
10、. Crucial for high fidelity(忠实性) of replication,5,5,3,3,5,5,3,3,前导链,随从链,岗崎片段,RNA引物,3-OH,DNA复制反应的共同特点,半保留复制 半不连续复制 有特定的复制起点 需要引物 复制真实性 复制叉双向移动，DNA合成的单向延伸， 5 3 复制受控制,DNA replication,第2节 细菌DNA的复制,一、 DNA复制所需的蛋白质和酶 二、 DNA复制的过程 三、 DNA复制的方式,一、 DNA复制所需的蛋白质和酶,1.DNA链合成的条件 底物: dATP, dGTP, dCTP, dTTP Mg+ 3-OH p
11、rimer DNA template Proteins and enzymes,2. DNA复制所需的蛋白质和酶,DNA helicase (DNA解旋酶) single-stranded binding protein (SSB, 单链结合蛋白) DNA primase (DNA 引发酶) DNA topoisomerase (拓扑异构酶) Primosome (引发体) DNA polymerase (DNA聚合酶) DNA ligase (DNA 连接酶),DNA helicase (DNA解旋酶),利用ATP供能，解开DNA双链, 可随复制叉的伸展向前移动,大肠杆菌中解旋酶的种类,si
12、ngle-stranded binding protein (SSB, 单链结合蛋白),稳定已被解开的DNA单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。 使单链DNA 呈伸展状态，无弯曲和结节，有利于作为模板,DNA primase (DNA 引发酶),在模板复制的起始部位，以DNA为模板催化互补碱基聚合生成一小段RNA e.g. DNa G (E. coli),DNA topoisomerase (拓扑异构酶),是一类调节DNA分子的超螺旋水平，可改变DNA拓扑性质的酶。对DNA分子的作用是既能水解、又能连接磷酸二酯键。 拓扑异构酶 I: 切开DNA双链中的一股，使DNA在解链旋转中不打结，DN
13、A变为松弛状态再封闭切口。 同转录有关 拓扑异构酶 II: 能切断DNA双链，使螺旋松弛。在ATP参与下，松弛的DNA进入负超螺旋，再连接断端。同复制有关,Primosome (引发体),A mobile complex includes helicase (DNaA, DNaB, DNaC) and DNA primase. 由多种蛋白质及酶组成,是DNA复制开始所必需的.,主要是对DNA损伤的修复；以及在DNA复制时切除RNA引物并填补其留下的空隙。,修复紫外光引起的DNA损伤,DNA 复制的主要 聚合酶，还具有3-5 外切酶的校对功能，提高DNA复制的保真性,DNA polymerase
14、 (DNA聚合酶),DNA polymerase III,DNA polymerase III 二聚体复合物 由10种亚基( ) 组成不对称异源二聚体。 核心酶（）,DNA polymerase III holoenzyme,DNApol 各亚基的功能,亚基：53 聚合酶活性 亚基：夹稳模板链并使酶沿模板链滑动 复合物（、）：促进全酶组装至模板及增强核心酶活性 亚基：3 5外切酶活性和碱基选择功能，是复制保真性所必需 亚基: 可能起组装作用,单林娜 制作,52,3 5 5 3 exonuclease polymerase,N,C,5 3 exonuclease,小片段,大片段（ klenow片
15、段）,切除RNA引物 损伤修复,校读功能,（常用的工具酶）,DNA Polymerase,聚合功能,2.核酸外切酶活性,35外切酶活性： 切除错配的核苷酸,53外切酶活性： 切除引物 切除突变的片段,？,DNA ligase 连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，形成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成完整的链。反应需要ATP。,ATP,二、 DNA复制的过程,(1) Initiation (起始) (2) Elongation (延伸) (3) Termination and segregation (终止与分离),(1) Initiation (起始),识别原点 分开双链，稳定单链 通过引发体起动子代链的合成反应,The structure of E.Coli origin oriC,单林娜 制作,59,只有完全甲基化的起点能够起始复制，半甲基化的起点在其完全恢复甲基化状态之前不能起始复制。,单林娜 制作,HU ATPDnaA,13bp segments,OriC,Supercolled template,1,单林娜
