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1、第七章 层析技术,第一节 层析的基本原理及分类 第二节 凝胶过滤层析 第三节 离子交换层析 第四节 疏水性相互作用层析 第五节 亲和层析 第六节 反相层析,学习目标,了解层析方法的分类及各种层析方法的应用特点； 掌握层析的基本原理及各种层析方法的原理及操作； 能利用各种层析技术对生物物质进行分离纯化。,第一节 层析的基本原理及分类,一、层析的基本原理 层析是根据混合物中溶质在互不混溶的两相之间分配行为的差别，引起移动速度的不同而进行分离的方法。典型的柱层析分离设备示于图7-1中。,图7-1柱层析分离设备,1分离理论基础 互不混溶的两相分别称为固定相(stationary phase)和流动相(
2、mobile phase)。固定相填充于柱中，在柱的顶端(入口)加入一定量的料液后，连续输入流动相，料液中的溶质在流动相和固定相之间发生扩散传质，产生分配平衡。由于各组分在固定相中的分配系数（或溶解、吸附、交换、渗透或亲和能力）的差异，使各组分随流动相移动的速率不同，分配系数大的溶质在固定相上存在的几率大，随流动相移动的速度小。因此当流动相移动一定柱长后，使各组分在层析柱内分层，从而达到各组分分离的目的。在层析柱出口处各个溶质的浓度变化如下图7-2所示。,图7-2 层析柱出口处各个溶质的浓度变化 在定温定压条件下，当色谱分离过程达到平衡状态时，某种组分在固定相S和流动相m中含量（浓度）C的比值
3、，称为平衡系数K（也可以是分配系数、吸附系数、选择性系数等）。,其表达通式可写为： （7-1）,式中 K平衡系数（分配系数、吸附系数、选择性系数等）； Cs固定相中的浓度； Cm流动相中的浓度。 平衡系数K主要与下列因素有关：被分离物质本身的性质；固定相和流动相的性质；色谱柱的操作温度。一般情况下，温度与平衡系数成反比，各组分平衡系数K的差异程度决定了色谱分离的效果，K值差异越大，色谱分离效果越理想。,2阻滞因数或比移值Rf 在色谱柱（纸、板）中，溶质的移动速度与流动相的移动速度之比，称为阻滞因数或比移值Rf，其定义式可写为：,令As为固定相平均截面积，Am为流动相平均截面积，则系统或柱的总截
4、面积At=As+Am。设体积为V的流动相流过色谱系统，流速很慢，可以认为溶质在两相间平衡，则：,流动相移动距离 = V/Am,由阻滞因数的定义式可得：,因此，当Am、As一定时（与装柱时的紧密程度有关），一定的平衡系数K有相应的Rf值。 3色谱图及基本概念 混合液中各组分经色谱柱分离后，随流动相依次流出色谱柱进入检测器，检测器的响应信号时间曲线或检测器的响应信号流动相体积曲线，称为色谱流出曲线，又称色谱图，如图7-3所示。色谱图的纵坐标为检测器的响应信号；横坐标为时间t，也可用流动相体积V或距离L表示。,（1）基线 在操作条件下，色谱柱出口处没有组分流出，仅有纯流动相流过检测器，此时的流出曲线
5、称为基线，如图7-3中OC曲线。使基线发生细小波动的现象称为噪音，如图7-3中的空气峰。基线反映了操作条件下，检测器系统噪声随时间变化的波动情况，稳定的基线应是一条平行于横坐标的直线。,图7-3 色谱图,（2）色谱峰 当样品中的组分随流动相流入检测器时，检测器的响应信号大小随时间变化所形成的峰形曲线称为色谱峰，峰的起点和终点的连接直线称为峰底。 （3）峰形 正常的色谱流出曲线为对称于峰尖的正态分布曲线，如图7-4(a)所示。但实际上，流出曲线并非完全对称，不正常的色谱峰有拖尾峰和前伸峰，如图7-4(b)、(c)所示。,(a) (b) (c) 图7-4 峰形示意图,（4）保留值 表示混合物中各组
6、分在色谱柱中停留时间或将组分带出色谱柱所需流动相体积的数值，称为保留值。保留值可作为定性分析的参数，由于计量单位的不同，分别称为保留时间、保留体积。 保留时间tR 从开始进样至柱出口处被测组分出现浓度最大值时所需的时间，称为保留时间，如图7-3所示。 保留体积VR 从开始进样到柱出口处被测组分出现浓度最大值时所通过的流动相体积，称为保留体积。 死时间t0 不被固定相滞留的组分（气相色谱中如空气、甲烷等），从开始进样到柱出口处出现浓度最大值时所需的时间称为死时间，其值等于流动相流经色谱柱的时间，如图7-3所示。,死体积V0 不被固定相滞留的组分，从进样到出现最大峰值所需流动相的体积，称为死体积。
7、它可由死时间t0与色谱柱出口处流动相的体积流速Fc来计算，即V0 = t0Fc。 校正保留时间tR 扣除死时间后的保留时间称为校正保留时间（或调整保留时间），如图7-3所示；校正保留时间可理解为组分在固定相中实际滞留的时间。其定义式为： tR = tR - t0 校正保留体积VR 扣除死体积后的保留体积称为校正保留体积（或调整保留体积）；其定义式为： VR = VRV0 VR与tR之间的关系为： VR = tR Fc 死体积V0反映了色谱柱的几何特性，它与被测物质的性质无关。保留体积VR中扣除死体积V0后，即校正保留体积VR，将更合理地反映被测组分的保留特点。,相对保留值r2,1 在相同的操作
8、条件下，待测组分与参比组分的校正保留值之比，称为相对保留值，又称为选择因子。,其定义式为： （7-2） 式中 tR2、tR1 分别为被测物质和参比物质的校正保留时间； VR1、VR2 分别为被测物质和参比物质的校正保留体积。 相对保留值r2,1可以消除某些操作条件对保留值的影响，只要柱温、固定相和流动相的性质保持不变，即使填充情况、柱长、柱径及流动相流速有所变化，相对保留值仍保持不变。,（5）峰高与峰面积 色谱峰顶点与峰底之间的垂直距离称为峰高，用h表示；峰与峰底之间的面积称为峰面积，用A表示，可作为定量分析的参数。 （6）区域宽度 色谱峰的区域宽度可衡量柱效，并且可与峰高相乘来计算峰面积，如
9、图7-3所示。色谱峰的区域宽度通常有三种表示方法： 标准偏差 即0.607h峰高处的峰宽的二分之一。 半高峰宽W1/2 即1/2峰高处的峰宽。它与标准偏差的关系为：W1/2 = 2.355。 峰宽W 自色谱峰两侧的转折点（拐点）处所作的切线与峰底相交于两点，此两点间的距离称为峰宽。它与标准偏差的关系为：W = 4。 标准偏差、峰宽与半高峰宽的单位由色谱峰横坐标单位而定，可以是时间、体积或距离等。在理想的色谱中，组分的谱带应是很窄的，若谱带较宽，将直接导致分离效果下降。,（7）分离度R 是指相邻两色谱峰保留值之差与两组分色谱峰峰底宽度平均值之比值，即： （7-3） 式中 tR1、tR2分别为组分
10、1和2的保留时间(也可采用其它保留值)； W1、W2分别为组分1和2的色谱峰的峰底宽度，与保留值的单位相同。 分离度R综合考虑了保留值的差值与峰宽两方面的因素对柱效率的影响，可衡量色谱柱的总分离效能。,根据分离度R的大小可以判断被物质在色谱柱中的分离情况；R值越大，两色谱峰的距离越远，分离效果就越好，如图7-5所示。当R1时，两峰有部分重叠；当R = 1时，两峰有98%的分离；当R = 1.5时，分离程度可达99.7%；一般用R = 1.5作为相邻两峰完全分离的标志。,图7-5 分离度影响示意图,（8）柱效 柱效是表达色谱柱性能的一个重要参数，可用塔板数N和塔板高度H表示，其计算式为：,假设色
11、谱柱的内径和柱内的填料是均匀一致的，混合液流经一小段色谱柱后，各组分在两相间达平衡。这一小段色谱柱可看成是一个理论塔板，相当于精馏操作中的一块理论塔板，一个理论塔板所对应的色谱柱的长度称为理论塔板高度（理论板高），一个色谱柱可包含若干个理论塔板。理论塔板数的多少可反映色谱柱分离性能的优劣。单位长度色谱柱内包含的理论塔板数越多，流动相通过的塔板数也越多，说明流动相流过色谱柱的平衡次数越多，色谱柱的分离效率就越高。,（9）色谱流出曲线的意义 色谱峰数等于样品中单组分的最少个数；色谱保留值是定性分析的依据；色谱峰高或面积是定量分析的依据；色谱保留值或区域宽度是色谱柱分离效能的评价指标；色谱峰间距是固
12、定相或流动相选择是否合适的判定依据。 二、层析分类 1流动相与固定相 层析法根据流动相的相态分气相层析法、液相层析法和超临界流体层析法。而固定相有固体、液体和以固体为载体的液体薄层。生物物质一般存在于水溶液中，因此，生物分离主要采用液相层析法，如固定相为液体的分配层析法，如固定相为固体的吸附层析法及固定相为固定于固体表面的液体薄层（以固体为载体）的分配层析法等。,2固定相的形状 根据固定相或层析装置形状的不同，液相层析法又分纸层析法(Paper chromatography)、薄层层析法(Thin1ayer chromatography)和柱层析法(Column chromatography)
13、。纸层析和薄层层析多用于分析目的，而柱层析易于放大，适用于大量制备分离，是主要的层析分离手段。 3压力 在以固体(包括以固体为载体的液体薄层)为固定相的液相层析中，根据操作压力的不同，又分为低压(压力一般小于0.5MPa)、中压(压力为0.540MPa)和高压(压力为4.040MPa)液相层析法。高压液相层析法中层析介质（固定相）微细，分离精度高、速度快，主要用于成分分析。大量制备分离常用低压或中压液相层析法。,第二节 凝胶过滤层析,一、原理与操作 1凝胶层析的原理 凝胶过滤层析(Gel filtration chromatography，GFC)又称体积排阻层析、分子筛层析，是利用凝胶粒子(
14、通常称为凝胶过滤介质)为固定相，根据料液中溶质相对分子质量的差别进行分离的液相层析法。如图7-6所示，在装填具有一定孔径分布的凝胶过滤介质的层析柱中，料液中溶质1的相对分子质量很大，不能进入到凝胶的细孔中，因而从凝胶间的床层空隙流过，洗脱体积为层析柱的空隙体积；对子溶质4，其相对分子质量很小，能够进入到凝胶的所有细孔中，因而其洗脱体积接近柱体积；相对分子质量介于溶质1和溶质4之间的溶质2和3可进入到凝胶的部分细孔中，故其洗脱体积介于空隙体积和柱体积之间，根据相对分子质量的差别（溶质2的相对分子质量大于溶质3）顺序洗脱。相对分子质量大于溶质l和小于溶质4的溶质的洗脱体积分别与溶质1和溶质4相同。
15、,第二节 凝胶过滤层析,图7-6 GFC的分离原理及洗脱曲线,GFC操作中溶质的分配系数M只是相对分子质量、分子形状和凝胶结构(孔径分布)的函数，与所用洗脱液的pH值和离子强度等物性无关，即在一般的层析操作条件下、相对分子质量一定的溶质的分配系数为常数。因此，GFC操作一般采用组成一定的洗脱液进行洗脱展开，这种洗脱法称为恒定洗脱法(isocratIc elution)。 2凝胶层析的操作 （1）凝胶的处理 葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶上以干品出售的，所以在使用前必须溶胀。可以将它们浸泡在洗脱剂中，慢慢搅拌。洗脱剂应具有一定的离子强度（约为0.08）。,（2）装柱 装柱前，柱的底部要先放些玻璃棉、
16、玻璃细孔板等可拆卸的支持物，以支持固定相。凝胶要悬浮在洗脱剂中，在搅拌下缓慢加入柱中，使凝胶自然沉积，直到所需高度为止。床层要均匀，不能有纹路或气泡。装柱时要考虑凝胶的承压能力，如压力太高，凝胶会被挤压变形而影响流速。 （3）上样和洗脱 柱床经洗脱剂平衡后，在床顶部留下数毫升洗脱剂，再用滴管轻轻沿柱壁将试样加入至柱的上面，防止扰动填充层表面，打开柱底部的流出口，使样品液渗入凝胶床内。当样品液面恰与凝胶床表面平时，加入数毫升洗脱剂冲洗管壁。这一步关键是既要使样品恰好全部渗入凝胶床，又不致使凝胶表面干燥而发生裂缝。然后用大量洗脱剂洗脱，并收集相应的洗脱液。 非水溶性物质的洗脱采用有机溶剂（如苯和丙酮），水溶性物质的洗脱一般采用水或具有不同离子强度和pH的缓冲液。PH的影响与被分离物质的酸碱性有关，在酸性pH时碱性物质易于洗脱，在碱性pH时酸性物质易于洗脱。多糖类物质的洗脱以水为最佳，有时
