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1、8、微生物的快速检测,常见微生物检测项目,常规微生物项目：细菌总数、大肠菌群、大肠杆菌、酵母总数、霉菌总数。 致病微生物项目：沙门氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157：H7、弯曲杆菌、致病弧菌、副溶血弧菌、志贺氏菌、假单胞菌等。,国家标准GB/T 4789 1-40：食品卫生微生物学检验：菌落总数测定、大肠菌群计数、沙门氏菌检验、志贺氏菌检验、致泄大肠埃希氏菌检验、副溶血性弧菌检验、小肠结肠炎耶尔森氏菌检验、空肠弯曲菌检验、金黄色葡萄球菌检验、溶血性链球菌检验、肉毒梭菌及肉毒毒素检验、产气荚膜梭菌检验、蜡样芽孢杆菌检验、霉菌和酵母菌计数、常见产毒霉菌的鉴定、椰毒假单胞菌酵米面亚种检
2、验、单核细胞增生李斯特氏菌检验、肠杆菌科噬菌体检验、大肠菌群快速测定、双歧杆菌检验、乳酸菌检验、大肠埃希氏菌O157：H7/NM检验、阪崎肠杆菌检验等。,政府检测机构为什么需要微生物快速检测？,提高检测效率 节约人力资源成本 与国际接轨,国内外食品安全形势严峻，恶性事件不断发生。 欧洲“二噁英”、“疯牛病”（20世纪90年代） 日本大肠杆菌O157:H7中毒（1996） 中国SARS（2003） 、东南亚国家禽流感（2004） 美国菠菜大肠杆菌O157:H7污染事件（2006）,日益严峻的食品安全局势的需要,企业为什么需要微生物快速检测？,市场销售环节要求快速出货。尤其是一些保质期较短的产品。
3、 减少物流的压力，尽可能减少仓存，加快资金周转。 节约人力资源成本（外资企业尤其突出） 对于运行HACCP质量保证体系的企业来说，快速检测方法尤其重要。可以快速检测原料及半成品的污染情况，以采取相应的措施控制最终产品的微生物超标情况。,快速检测方法势在必行！,国外许多政府检测机构都在大量使用快速检测方法，尤其是ATP法、免疫法、阻抗法和显色培养基法在国外应用相当成功。 国内的许多政府检测机构也都已经在使用或正在考虑使用国外先进的快速检测技术。 从长远发展趋势来说，快速方法是微生物检测的一大方向。,一、常规微生物快速检测技术现状,传统计数改良法： 1、螺旋平板计数法：螺旋接种仪菌落计数 2、滤膜
4、法：常用于一些可过滤样品的检测。 3、纸片法：培养基固定在载体上。省去制做培养基的时间。主要用于细菌总数检测。 4、其它：如Simplate即用胶,改良MPN产品。,螺旋平板法,DWS螺旋平板接种仪,aColyte自动菌落计数仪,螺旋平板原理,平皿旋转,接种针往外移动 同时自动将样品 稀释1000倍,螺旋平板法的优缺点,优点： 与传统方法相比，无需稀释3个梯度，每个梯度倒2个平板，节省了大量人力物力。 缺点： 检测时间并没有缩短，菌落总数仍需要培养48小时。 需要配合自动菌落计数仪，否则人工计数更麻烦。,滤 膜 法,滤膜法常用于可过滤样品的微生物检测。 优点：灵敏度增大，菌落无扩散情况，便于计
5、数。 缺点：需要额外的支出购买真空泵，多联支架及一次性滤膜；如果抽滤过程空气洁净度不够，有可能造成二次污染，尤其是对菌数要求特别严格的产品，如啤酒，澄清果汁，桶装饮用水等。,皿膜法以纸片法为代表,优点：无需制备培养基，携带方便，非漫延菌落计数较方便。 缺点：不能节省检测时间。检测成本相对偏高。大肠菌群纸片存在与MPN法无法对应的问题，金黄色葡萄球菌纸片存在取样量太低的问题。目前仅细菌总数纸片有一些用户。,纸片法是目前被广泛接受的方法。国标餐具大肠菌群采用的就是纸片法。,其它即用胶，MPN改良法,Simplate,colilert,主要用于水样或澄清样品的大肠菌群或大肠杆菌检测,SimPlate
6、TMTPC 法：基于食源性细菌的蛋白质有特异性酶类，TPC培养基内含有多种细菌酶类所对应的底物。检样被细菌污染时，只要具有一种酶的活性即能与底物作用生成4-甲基伞形酮，培养24h后，在紫外线照射下，发出蓝色荧光。 食源性细菌悬浮于TPC培养基表面，在分隔的小池内能迅速进行生化反应，若有检样颗粒亦无干扰；它不是由48h形成的菌落来计数，而是24h后在紫外灯照射下记录培养皿内能发出蓝色荧光的阳性池数，进而由最大近似值(MPN) 表查出细菌的MPN。阳性池数与MPN 呈松泊分布。,固定底物技术酶底物法，需要coliert试剂 采用大肠菌群细菌能产生D-半乳糖苷酶分解ONPG（邻硝基苯-D-半乳吡喃糖
7、苷）使培养液呈黄色，以及大肠埃希氏菌产生D-葡萄糖醛酸酶分解MUG（4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷 ）使培养液在波长366nm紫外光下产生荧光的原理，来判断水样中是否含有大肠菌群及大肠埃希氏菌。只需24小时即可同时定量出水样中大肠菌群和大肠埃希氏菌的MPN值。,二、常规微生物快速检测技术现状,快速检测微生物数量的新方法： 1、ATP法：目前产品较多，如CHARM，Biotrace, 等。 2、电化学法：Sy-Lab公司Bactrac 4300，Tempo, 3、颜色变化：如梅里埃的Bact/Alert和Foss的MicroFoss。 4、流式细胞技术及激光扫描技术 5、其它：热量法，放射测量
8、法,表面洁净的检测方法,微生物学法：纸片、琼脂板、棉签拭子、海绵拭子 非微生物学法（快速法）：ATP(三磷酸腺苷，蛋白质, 降解糖、NADP(辅酶II)，其它。,ATP-三磷酸腺苷,ATP来源于,细菌 酵母 霉菌 生物膜 组织残留,废弃物污染 人的污染,（一）ATP法,1. 人接触设备或器具 2. 设备或器具被污染 3. 清洗不正常 4. 非正常的敏感物污染 5. 微生物污染,ATP 存在表明什么？,检测原理,荧光素,荧光素酶,腺苷一磷酸,氧合荧光素,荧光,ATP法两大用途,1、用于食品、化妆品和药品企业对生产线和管道进行快速清洁程度检测。政府检测机构用ATP方法缺乏法律依据。ATP法与微生物
9、数量没有必然的联系。 2、改良后用于食品、化妆品的商业无菌检测或终产品检验。,LUMT清洁程度快速检测,1)将水样在玻璃纤维过滤器上过滤以便富集微生物； 2)用适当的溶解剂溶解细胞； 3)用适当的萃取剂萃取ATP； 4)将ATP的萃取液加到盛有萤光素、萤光素酶的试管中，并用光度计记录下所产生光的量，将此读数和ATP浓度标准曲线相比较，就可得到待测样品中ATP含量；用得到的ATP含量确定水样中细菌数量。,LUM-T的独特优势,CHEF 熟肉制品成熟度检验 MicroQ 水中微生物污染程度检测 Cidelite 杀虫剂残留初筛 Paslite 牛奶巴氏消毒效果 Somalite 体细胞计数 SL/
10、MRL test 抗生素残留检测（连接ROSA imager),Charm ATP 检测,基于ATP原理的用于成品检测的 微生物检测系统,Charm LUM-96 （用于UHT产品-高温瞬间灭菌） Biotrace Celsis（主要用于化妆品） Millipore公司的MicroScan,Celsis和LUM-96,保温2天，检测30分钟（96个样）,ATP法检测成品的优缺点,优点：LUM-96通常用于进行商业无菌检测。可大大缩短库存时间，减少物流压力和成本。 缺点：ATP方法需要消耗大量的较昂贵的试剂，对仪器的清洗保养要求特别高。另外，客户通常怀疑假阴性的可能，特别是用ATP单个检测代替常
11、规微生物和致病微生物检测，其风险是一定存在的。(如保温增菌时间不够，菌数未达到一定数量，取样量太小，由于培养基原因，目标致病菌未大量增菌等原因),Millipore公司最新推出的MicroStar,MicroStar的原理及局限性,MicroStar快速微生物检测系统是结合了生物荧光、膜过滤及CCD荧光照相检测等技术的新型检测系统. 可过滤样品经膜过滤后，将菌截留在特殊的滤膜上，滤膜放置在培养基表面增菌后取出，加ATP释放剂，然后加荧光素和荧光素酶，显示的荧光信号在荧光显微镜或荧光检测器下观察并计数。,MicroStar的优缺点,优点：缩短培养时间，提高灵敏度。适合于菌数较低的可过滤产品使用。
12、 缺点：仪器较昂贵，运行成本也非常贵。不能用于检测未知的可能菌数较高的样品(不知稀释多少倍，因菌数必须稀释至80个左右)。整个检测时间还不够快，通常需16小时以上。,（二）电化学方法(电导率法或电阻抗法),奥地利Sylab公司的Bactrac4300和Biotrac4200 梅里埃公司的Bactometer和Tempo 英国Multhus公司(已倒闭) 英国DWS公司的Rabit ,外观比较,Bactrac4300,梅里埃的BactoMeter,DWS公司的Rabit,马色斯120,世界上最好的电化学微生物快速检测产品 Bactrac 4300系统,Sy-lab Bactrac4300常规微生
13、物项目快速检测技术,MicroFoss(Biosys) 微生物自动监测仪,微生物生长导致培养基 pH值发生变化，由光学 检测器检测底部琼脂层 的颜色变化，记录达到 突变点的时间。,Microfoss的特点,与阻抗法类似，可以实现快速检测。 缺点：需要购买原厂的预装培养基，应用范围受限制，成本高昂。因此在我国目前还没有用户。,梅里埃的BacT/Alert微生物检测仪,基于微生物生成产生CO2的原理。CO2积累越多，底部的CO2传感器变黄，由LED发射一束光至底部，探头检测反射光的强度。光强度与微生物数量有一定关系。,方法较新，用户还需要一个过程了解。,流式细胞计数技术,用于非过滤产品,流式细胞
14、: 线性流体 单细胞分析 灵敏的检测头,流式细胞术（FCM）是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数的、快速的定量分析和分选的技术,（三）流式细胞技术及激光扫描技术,FOSS公司 BactoScan FC牛奶中总菌数快速检测仪,采用流式细胞原理。对微生物进行核酸染色，用流式细胞技术进行计数,BactoScan FC的优缺点,优点：速度快(50-150样品/小时) 缺点：死活细胞一起检测，消耗成本较高，仪器比较难保养。灵敏度不够高。 适合牛奶企业检测原奶中细菌总数。,美国Chemunex公司 微生物快速检测系统,美国Chemunex公司将流式细胞技术与活细胞荧光探针标记及激光扫描技
15、术相结合，推出的最新一代的速度更快的Bactiflow以及更高端的ScanRDI和D-count微生物快速检测仪。 其最大的特点是只检测活细胞数，速度极快，处理量大。与FOSS的BactoScan FC检测死活细胞都检测不同。 是目前国际上正在认可的生物荧光定量检测微生物数量的两种方法之一。另一种是Millipore的一款叫MicroStar的基于ATP检测的产品。,荧光酶标记原理,直接单细胞标记 (包括孢子) 细胞无增菌要求 标记在90分钟内完成 直接对活细胞和酵母进行标记,标记的细菌,标记后的酵母,标记后的霉菌,ChemScan RDI,三个简单的步骤,2. 标记,3. 激光扫描,1. 过
16、滤,检测步骤 - TVC,1. 过滤,2. 标记,3. 激光扫描,样品过滤,预标记 60 min,滤膜转移,ChemScanRDI 仪器分析,标记 30 min,ChemScan RDI 主机,激光扫描分析仪 3 分钟分析时间 结果直接显示细胞个数,Laser scanning,Microscope Confirmation,Bactiflow,适合实验室或研究用 日处理量不大于40个样品,DCount,适合实验室或生产现场使用 日处理量大于40个样品的场合,标记和检测原理,Enzyme,Viability substrate,Free fluorochrome,Micro-organism,Detector,Detector,Laser,Flow Cell,细胞标记 12 minutes,细胞计数 1 minute,自动吸样 无需预处理 每批可做64 个样，含阴性和阳性质控,最小的人力要求,全自动标记和过滤 加所有要求的标记试剂 控制温育时间和温度 去除大的颗粒 (25 m尼龙网过滤),快速敏感的
