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1、三萜皂苷类成分的抗衰老作用与质量分析研究,一三萜皂苷的研究概况,三萜皂甙是由六个异戊二烯以头尾相接或尾尾相接而组成，一般由含30个碳原子。按其皂甙元，可将三萜皂甙分为五环三萜(pentacylic triterpennoids)和四环三萜(tetracylic triterpennoids)两大类。 五环三萜皂甙数目较多，又可分为七种类型：齐墩果烷(oleanane)型、羽扇豆烷(ursane)型、木栓烷(lupane)型、异B-香树脂醇(iso-B-amyrin)型、羊齿烷(fernane)和异羊齿烷(isofernane)型、何帕烷(hopane)和异何帕烷(isohopane)型。四环三
2、萜皂甙除含有C30外，也有C31或C32的衍生物，主要有四种类型：达玛烷(dammarane)型、羊毛脂烷(lanostane)型、大戟烷(euphane)型、葫芦烷(cucurbitane)型。,三萜皂甙在植物界有较广泛的分布，据报道在104科1730种植物中，含有皂甙的植物就约有79 科860 种，其中含有三萜皂甙的植物就约有627 种。 三萜皂甙在双子叶植物中分布较为普遍，较多种的科有五加科、伞形科、夹竹桃科、菊科、石斛科、葫芦科、大戟科、豆科、桃金娘科、远志科、毛莨科、蔷嶶科、茜草科等；单子叶植物含三萜皂甙的植物较少见，仅见于禾本科的少数属；裸子植物及低等植物中也较少含有这类皂甙；另外
3、在海洋生物如海参、海星、海盘车等中亦有存在。,许多常见中药中含三萜皂甙，如人参、三七、甘草、西洋参、地榆、款冬花、酸枣仁、紫菀、桔梗、柴胡、远志、黄芪、威灵仙、商陆、白头翁等。 皂甙类成分具多种生理活性，如刺激黏膜，已往常用作祛痰药，如桔梗、远志、紫菀中的皂甙等。经研究发现三萜皂甙还具有促进核酸蛋白质合成和胆固醇脂代谢、抗炎、抗菌、抑制肿瘤、抗溃疡、兴奋或抑制中枢神经、抑制胃液分泌以及杀死精子、软体动物等作用。,目前对天然药物的抗衰老作用，多从其对免疫功能、神经系统、内分泌系统、物质代谢、抗衰老自由基、延长细胞和动物的寿命、抗肿瘤、强壮、延长生长期等方面的作用来评价。 而不少皂甙具有上述作用，
4、特别是三萜皂甙的活性更显著。如人参、西洋参、三七和绞股蓝等是常见具抗衰老作用的天然药物。它们均富含三萜类达玛烷型皂甙。,达玛烷型皂甙除了上述活性外，在血压、血糖等项指标上，还具有明显的双向调节作用。这一种特性对抗衰老药物来说颇为有益的，它可使发病失去某种平衡的机体恢复新的动态平衡，所以这类成分的研究倍受关注。 另外报道在约6科28种植物含有达玛烷型皂甙，从中寻找出有效的抗衰老药物是完全可能的。,二三萜皂苷抗衰老作用,A. 人参皂苷 1. 有网状内皮系统吞噬功能激活效果；对特异性和非特异性免疫功能有刺激作用。 2. 可提高小鼠对常压、低压缺氧的耐力，并可延长常温、高温负荷下游泳时间。 3. 有中
5、枢兴奋作用，能激发人学习和记忆能力，增减智力和操作能力。 4. 具有兴奋垂体-肾上腺皮质功能的作用,5. 有性腺激素样作用；有雄性激素样作用，能使小鼠精囊腺增重。 6. 能促进DNA、RNA、蛋白质和脂肪酸的合成，使白蛋白和丙种球蛋白的含量增加。 7. 对肾上腺素高血糖的抑制作用较强。并显示对动物血糖水平有双向调节作用。 8. 可明显抑制中、老年大、小鼠的脂质过氧化作用。可延长细胞生长天数。,B. 三七皂苷,1. 可显著提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数。 2. 对未成年小鼠体重增加有明显促进作用；可增强小鼠耐高、低温能力。 3. 能显著降低老年大鼠脑组织脂褐质及血清过氧化脂质总含量。 4
6、. 有雄性激素样作用，能使小鼠精囊腺增重。 5. 有促进小鼠肝、肾DNA及血清蛋白质合成的作用。 6. 可明显抑制中、老年大、小鼠的脂质过氧化作用。 7. 总皂苷抗血栓。,C. 西洋参皂苷,1. 能降低ACTH引起的小鼠胸腺及脾脏的萎缩。 2. 可增强机体对缺氧的耐受力，延长小鼠负重游泳时间。,D 绞股蓝皂苷,1. 能明显提高小鼠游泳的体力和耐力，并咳提高常压缺氧的耐受力。 2. 能促进小鼠生长发育，增强小鼠耐高温、抗疲劳的作用。 3. 能预防地塞米松引起的肾上腺皮质激素、血浆皮质醇减少。 4. 可预防地塞米松引起的胸腺萎缩。 5. 对喂高蔗糖、高脂的大鼠所致的高脂血症有效。 6. 能增加自由
7、基损伤模型大鼠和老年大鼠红细胞中SOD的活力。 7. 对肝、子宫、肺等癌细胞增生的抑制率为20%-80%；对S180有明显的抑制作用。,E 黄芪皂苷,1. 黄芪甲苷有促进B细胞增生、分化和浆细胞抗体合成作用。 2. 黄芪甲苷、绵毛黄芪苷均可对抗CCl4所致的小鼠死亡；使小鼠红细胞内SOD活性升高。,F商陆皂苷,1. 商陆皂苷甲可显著减少羊红细胞致敏血清溶血素的含量。 2. 商陆总皂苷有对抗羟基脲所致小鼠体重下降、耐寒力低下的作用。,G酸枣仁皂苷,1. 酸枣仁总皂苷能显著降低正常大鼠血清胆固醇和LDL-C，显著升高HDL-C。 2. 可显著降低高脂饲养大鼠的血清甘油三酯。 3. 酸枣仁皂苷B能增
8、强N神经因子作用。,H. 龙牙楤木皂苷,1. 可使小鼠游泳时间显著延长，增强小鼠耐缺氧、抗低温作用。 2. 对KCN、NaNO2引起的中毒性缺氧小鼠有保护作用。,I大豆皂苷,1. 对链脲霉素所致糖尼尿病大鼠可降低血糖水平，提高SOD含量，降低脂质过氧化物。 2. 对预防高脂肪食物造成的高脂血症有作用。 3. 有降低抗肿瘤抗生素阿霉素所致心肌中过氧化脂质的上升。,K独一味皂苷,1. 能显著提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数、E-花环形成率及酯酶染色阳性率。 2. 对Hepa、EC瘤株均有一定的抑制作用。,L土贝母皂苷,1. 能抑制人体早幼粒细胞白血病细胞（HL60）的生长。 2. 可使酵母多
9、糖微粒的吞噬功能明显增加。,M柴胡皂苷,1. 柴胡总皂苷可促进大鼠促肾上腺皮质激素、皮质酮的分泌。 2. 柴胡皂苷d对小鼠艾氏腹水癌有抑制肿瘤生长作用，且能明显延长动物的生存时间。,三. 三萜皂苷的主要含量分析方法,中药及其制剂中三萜皂苷的含量分析可分为: 总皂苷测定 皂苷元测定 单体皂苷测定,总皂苷测定： 1. 提取：一般需要适当的溶剂提取。由于皂苷在极性溶剂中溶解度较大，提取溶剂可为各种浓度的甲醇、乙醇和异丙醇、丁醇、戊醇。 2. 精制：水饱和的正丁醇萃取；大孔树脂处理后溶剂洗脱。 3. 测定：最常用的方法为比色法，也有用重量法的。,皂苷元测定： 提取：1先用上述方法得到总皂苷，再加酸（如
10、硫酸、盐酸）加热水解，得皂苷元。 2将样品先行水解，再用有机溶剂从水解的混合液中提取皂苷元。 测定：主要有薄层色谱法、高效液相色谱法和比色法。 单体皂苷测定：主要为薄层色谱法和高效液相色谱法。,(一) 比色法,皂苷类成分多无色，且常无紫外吸收。 含量测定时常需显色， 产生颜色-于可见光区比色测定 在紫外光区产生吸收-用紫外分光光度法测定。 皂苷类成分的颜色反应的专属性虽较差，但反应比较灵敏，方法简便，易行。,常用的显色剂有： 浓硫酸 高氯酸 硫酸-醋酐、硫酸-醋酐-冰醋酸或硫酸-冰醋酸 芳香醛-硫酸或芳香醛-高氯酸 其它试剂：对-二甲氨基苯甲醛，亚甲蓝等,(二) 薄层色谱法,1. 薄层条件 (
11、1) 吸附剂：硅胶，氧化铝 (2) 展开剂：皂苷；皂苷元 (3) 显色剂：25%磷钼酸乙醇溶液 硫酸：甲醇（1：1） 氯磺酸：醋酸（1：2） 碘蒸气,2. 含量测定方法： (1) 薄层-比色法 人参皂苷元的薄层-比色法测定 标准曲线：对照品为人参皂苷元（人参二醇、人参三醇、齐墩果酸），加5%香草醛-冰醋酸、高氯酸；再加醋酸，在560nm测定，做三条标准曲线 样品测定：硅胶G，条状点样；氯仿-甲醇-水(60:42:11 碘蒸气显色；刮取斑点范围硅胶，显色测定。测定三组皂苷的吸收度，分别于标准曲线中查得相应数值，乘以2.5、1.77与2.1倍，计算各组皂苷含量,(2) 薄层扫描法 A.人参单体皂苷
12、薄层扫描法测定 样品制备：甲醇，冷浸-热回流 对照：人参皂苷Ro、Rb1、Rb2、RC、Rd、Re、Rg1、Rg2 扫描条件：s=525nm，R=760nm；投射法线性 样品测定：GF254板， 显色剂为10%硫酸，115，10min 氯仿-甲醇-水（13:7:2）测定Ro、Rb1、Rg1、Rg2 正丁醇-醋酸乙酯-水（4:1:1）测定Rb2、RC、Rd、Re,B.三七中皂苷薄层扫描法测定 对照品：三七皂苷C1、D1、D2、E 扫描条件：s=525nm，R=700nm；反射法线性 样品测定：硅胶G板，显色剂为碳酸氢钠-无水乙醇 展开剂为1，2-二氯乙烷-正丁醇-甲醇-水（30:40:15:25
13、，下层）,(三) 高效液相色谱法,关键问题是测定条件和流动相的选择。 1. 测定条件选择 多无共轭体系（少数除外），通常利用末端吸收作为测定波长。 也可用示差折光检测器； 新近用蒸发光散射检测器（Evaporative light scattering detector，ELSD）,蒸发光散射检测器（ELSD）是一种通用型检测器，流动相由热气流使之热气化喷雾，再进入加热管，溶剂在此挥发。所得分析检测的物质颗粒通过一狭窄光束散射光，由光电倍增管收集。ELSD的响应取决于被分析物质颗粒的数量和大小。由于ELSD仅对不挥发被分析物质产生响应，即使是在梯度洗脱时也能提供平稳的基线。 ELSD已成功用于
14、皂甙、生物碱、萜类内酯、氨基酸和糖类等分析。是分析无紫外吸收及紫外吸收弱成分的有力工具。,2. 流动相的选择 皂苷类成分多用反相色谱柱。 常用流动相有乙腈、甲醇、纯水等。 对溶剂要求较高，最好是色谱醇。,四. 三萜皂苷的质量分析研究,(一) 三七中三萜皂苷的定量分析 三七为五加科植物三七Panax notoginseng (Burk) F. H. Chen的干燥根。功能散瘀止血，消肿定痛。 现代药理研究证明，三七中皂甙类成分为其活性成分。为了更好地对三七药材进行质量评价和制定更完善的控制指标，采用HPLC-ELSD对其主要皂甙人参皂甙Rg1、三七皂甙R1进行了含量测定，并用紫外分光光度法测定了
15、总皂甙的含量。,三七中皂甙类成分的含量测定可采用HPLC-UV及HPLC-RI法。前者用紫外检测器=203nm检测，因三七中皂甙类成分紫外吸收较差，受试剂影响很大，基线漂移大，使分析很难进行。后者用示差检测器，则灵敏度低，稳定性和选择性均较差。本文用ELSD检测器测定三七中主要皂甙人参皂甙Rg1的含量，因ELSD检测器为质量型检测器，且不受外部环境的干扰，试剂在检测器中全部蒸发，不干扰检测，灵敏度及稳定性均符合含量测定的要求。,A三七中总皂苷的含量测定,1供试品溶液的制备： 取本品粉末约0.5g，精密称定，置索氏提取器中，加乙醚80ml，置水浴上提取2h，弃去乙醚液，再加甲醇80ml提取4h，
16、甲醇提取液蒸干，残渣加水15ml使溶解，水溶液置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇萃取5次，每次15ml，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解，定溶至50ml，作为供试品溶液。对照品溶液为人参皂甙Rg1（5mg/100ml）。,2紫外吸收光谱： 仪器为岛津UV-2501pc紫外分光光度计；供试品紫外吸收曲线及最大吸收波长268nm与人参皂甙Rg1标准品完全一致,3标准曲线制备： 分别精密吸取对照品溶液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml置10ml量瓶中，置水浴中挥尽溶剂，取出，加浓硫酸0.6ml，摇匀，置80水浴中加热1h，取出，置冰浴中加95%乙醇至刻度，摇匀，在268nm波长处测定吸收度。 以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。经回归统计，得标准曲线方程：A=39.6856C+0.0148，r=0.9996。 浓度在5.04-25.20g/ml范围内，与吸收度呈线性关系。,4方法学考察： 回收率试验回收率为101.15%，RSD=1.44%；稳定性试验RSD为1.35%，总皂甙在
