《代谢控制和育种》ppt课件

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1、第四节 代谢调节控制育种,7 工业微生物代谢控制育种,第四节 代谢调节控制育种,代谢调节控制育种通过特定突变型的选育，达到改变代谢通路、降低支路代谢终产物的产生或切断支路代谢途径及提高细胞膜的透性，使代谢流向目的产物积累方向进行。,抗反馈调节突变株选育,1. 概念：指操纵基因或调节基因突变引起酶合成诱导机制失灵，菌株不经诱导也能合成酶、或不受终产物阻遏的调节突变型。 调节基因突变，致使不能形成活性化的阻抑物； 操纵基因突变，丧失和阻抑物结合的亲和力。 因此，可以利用一些易同化碳源或价廉易得的碳源作为基质生产所需的诱导酶类。 2. 筛选方法及实例 (1) 限量诱导物恒化培养 (2) 循环培养 (

2、3) 鉴别性培养基的利用 (4) 筛选,4.1 组成型突变株的选育,(1) 限量诱导物恒化培养,将野生型菌种经诱变后移接到低浓度诱导物的恒化器中连续培养,由于底物浓度低到对野生型不发生诱导作用，所以诱导型的野生菌不能生长,突变株由于不经诱导即可产生诱导酶而利用底物，因而得以生长成为组成型菌株,4.1 组成型突变株的选育,2. 筛选方法及实例,(2) 循环培养,含有诱导物 的培养基,不含诱导物 的培养基,交替连续循环培养,由于组成型突变株在两种培养基上都能产酶，生长逐渐占优势,4.1 组成型突变株的选育,2. 筛选方法及实例,(3) 鉴别性培养基的利用,甘油作惟一碳源,涂布诱 变孢子 悬液,喷上

3、O-硝基苯酚-D-半乳糖苷 (ONPG),组成型,诱导型,4.1 组成型突变株的选育,2. 筛选方法及实例,(4) 筛选 经诱变剂处理后的菌体移接到含有诱导能力低，但能作为良好碳源的诱导物的培养基中培养，突变体能良好生长，野生型不能生长。 例如：利用苯-半乳糖(PG)筛选-半乳糖苷酶组成型突变株。,4.1 组成型突变株的选育,2. 筛选方法及实例,概念：抗分解阻遏和抗分解抑制的突变株。 分解代谢阻遏现象：在初级或次级代谢中都存在，其含义是指代谢过程中酶的合成往往受高浓度的葡萄糖或其他易分解利用的碳源或氮源所抑制。 选育抗分解调节突变株(如碳源、氮源或磷酸盐分解调节)，其实就是筛选合成酶的产生不

4、受碳、氮、磷的代谢阻遏或抑制的突变株，使抗生素提前到菌体生长期开始合成，延长产抗期以提高产量。,4.2 抗分解调节突变株的选育,二、抗分解调节突变株的选育 抗分解阻遏、抗分解抑制,（一）解除碳源调节突变株的选育 （二）氮源 （三）磷酸盐,筛选此类突变株的目的 由于葡萄糖分解产物的积累，阻遏抗生素合成的关键酶，从而抑制抗生素的合成。在实际生产中，采用流加葡萄糖或应用混合碳源可以控制分解中间产物的累积来减少不利影响，但最根本的办法则是筛选抗碳源分解调节突变株，以解除上述调节机制，达到增产的目的。 筛选方法与实例 (1) 循环培养法 (2) 鉴别性培养基 (3) 特殊氮源 (4) 葡萄糖结构类似物,

5、4.2 抗分解调节突变株的选育,1. 解除碳源调节突变株的选育,(1) 循环培养法,快速利用的 碳源培养基,慢速利用的 碳源培养基,交替培养,突变型解除了阻遏现象，在乳糖的培养基上比野生型生长速度快，,4.2 抗分解调节突变株的选育,1. 解除碳源调节突变株的选育,(2) 鉴别性培养基,含有葡萄糖的琼脂平板,涂布诱 变后的 菌体,喷上O-硝基苯酚-D-半乳糖苷 (ONPG),突变型,野生型,4.2 抗分解调节突变株的选育,1. 解除碳源调节突变株的选育,(3) 特殊氮源 用葡萄糖为碳源，受阻遏酶的底物作为惟一氮源配制成培养基，连续移接诱变后的产气杆菌(Aerobacters aerogenes

6、)，可以筛选出不受葡萄糖阻遏的组氨酸酶突变株。,4.2 抗分解调节突变株的选育,1. 解除碳源调节突变株的选育,(4) 葡萄糖结构类似物 特性：2-dG和3-mG既不被微生物代谢又具有分解阻遏作用，因此可用来筛选抗分解阻遏的突变株。,2-dG,3-mG,4.2 抗分解调节突变株的选育,1. 解除碳源调节突变株的选育,4.葡萄糖结构类似物-（1）筛选方法,涂琼脂平板,出发菌株,诱变,抗2-dG或 3-mG 菌落优势生长,低浓度2-dG或3-mG 一种特殊碳源 经诱导酶水解才能利用,野生型菌株淘汰, 筛选方法 培养基要求含低浓度2-dG或3-mG及一种生长碳源，该碳源必须经相应的诱导酶水解才能被微

7、生物同化利用。 抗性突变株的性质 应用2-dG或3-mG不仅可以定向选育分解阻遏脱敏突变株，也可有效地分离到高产菌株。,4.2 抗分解调节突变株的选育,1. 解除碳源调节突变株的选育,(4) 葡萄糖结构类似物,2. 解除氮源分解调节突变株的选育 氮源分解调节：指含氮产物的酶受快速利用的氮源阻遏。 类型：细菌、酵母、霉菌等微生物对初级代谢产物的氮降解物具有调节作用。次级代谢的氮降解物的阻遏主要指铵盐和其他快速利用的氮源对抗生素生物合成具有分解调节作用。 实例：筛选芽孢杆菌中耐氨基酸菌株，是提高蛋白酶产量的一种有效方法。,4.2 抗分解调节突变株的选育,二、抗分解调节突变株的选育 （三）解除磷酸盐

8、调节突变株的选育 初级代谢必须 过量时影响次级代谢 磷酸盐基本耗竭，抗生素合成开始 发酵工业中，磷酸盐常被控制在亚适量。,3. 解除磷酸盐调节突变株的选育 （A）磷酸盐对次生产物的调节机制 (1) 通过初级代谢的变化影响次级代谢 加强初级代谢，推迟抗生素合成的起始； 改变糖类分解代谢途径，磷酸盐有利于糖酵解，从而降低戊糖途径的活力，导致某些以戊糖途径为先导的抗生素合成受抑制； 限制抗生素合成的诱导物； 抑制或阻遏磷酸脂酶类的合成。 (2) 磷酸盐对ATP调节：磷酸盐可能通过调节细胞内的效应物cAMP、ATP等来控制抗生素的基因表达。,4.2 抗分解调节突变株的选育,（B） 发酵过程中对磷酸盐的

9、控制 其添加浓度要严格限制在亚适量的水平，但最主要的目标是选育解除磷酸盐调节突变株。,4.2 抗分解调节突变株的选育,3. 解除磷酸盐调节突变株的选育,（C）抗磷酸突变株的筛选方法,4.2 抗分解调节突变株的选育,3. 解除磷酸 盐调节突变株的选育,营养缺陷型突变株的特性： （1）代谢障碍突变株，由结构基因突变引起合成代谢中一个酶失活，使某个生化反应发生遗传性障碍，使菌株丧失合成某种物质的能力，导致该菌株在培养基中不添加这种物质就无法生长。 （2）营养缺陷型菌株常常会使发生障碍的前一步的中间代谢产物得到累积，这就成为利用营养缺陷型菌株进行工业发酵来积累有用中间代谢产物的依据。 （3）营养缺陷型

10、菌株由于生物合成途径中某一步发生障碍，合成反应不能完成，从而解除了终产物反馈阻抑。外加限量需要的营养物质，克服生长的障碍，使终产物不至于积累到引起反馈调节的浓度，从而有利于中间产物或另一途径的某种终产物的积累。,4.3 营养缺陷型在代谢调节育种中的应用,在初级代谢调节育种中的应用 （1）直线式生物合成途径,4.3 营养缺陷型在代谢调节育种中的应用,（2） 分支式生物合成途径 实例1：谷氨酸棒状杆菌的L-谷氨酸生物合成途径,生物素缺陷型,硫胺素缺陷型,4.3 营养缺陷型在代谢调节育种中的应用,在初级代谢调节育种中的应用,实例2：谷氨酸棒状杆菌的腺核苷酸、鸟核苷酸的合成代谢途径,腺嘌呤缺陷型,协同

11、反馈抑制,实例3 高丝氨酸营养缺陷型菌株的赖氨酸合成途径,高丝氨酸缺陷型,协同反馈抑制,2. 在次级代谢调节育种中的应用 （1）抗生素增产：抗生素产生菌的营养缺陷株多数生产能力是下降的。然而，在初级或次级代谢产物的分支代谢途径中，营养缺陷型切断初级代谢支路，有可能使抗生素增产。,4.3 营养缺陷型在代谢调节育种中的应用,实例：四环素、制霉菌素产生菌的脂肪酸缺陷型可增加抗生素。,脂肪酸缺陷型,（2）新产品 实例： 金霉素第六碳原子上甲基是由蛋氨酸供应的，如果获得蛋氨酸缺陷型，阻断了蛋氨酸这一区段的合成，导致次级代谢中甲基供给受到限制，结果产生去甲基金霉素，而不产生金霉素。,4.3 营养缺陷型在代

12、谢调节育种中的应用,2. 在次级代谢调节育种中的应用,四、渗漏缺陷型在代谢调节育种中的应用 渗漏缺陷型：一种特殊的营养缺陷型。 遗传性代谢障碍不完全，酶活力下降而不完全丧失，能在基本培养基上少量生长 选育方法：. 营养缺陷型菌株接种于基本培养基 平板上 2. 挑菌（生长特别慢、菌落小）,概念：抗反馈调节突变株是一种解除合成代谢反馈调节机制的突变型菌株。其特点是所需产物不断积累，不会因其浓度超量而终止生产： 如果由于结构基因突变而使变构酶成为不能和代谢终产物相结合的，便是失去了反馈抑制的突变，称为“抗反馈突变型”； 如果是由于调节基因突变引起调节蛋白不能和代谢终产物相结合而失去阻遏作用的，称为“

13、抗阻遏突变型”。 一般而言，抗阻遏突变结果使胞内酶有可能成倍增长，而抗反馈突变的胞内酶量没有什么变化。但从作用效果上讲，均造成终产物大量积累，而且往往两种突变同时发生，难以区别。通常就统称为“抗反馈调节突变型”。,4.5 抗反馈调节突变株的选育,在实际应用中，抗反馈调节突变株的选育可以通过以下几个方面： 从遗传上解除反馈调节 (如各种抗性和耐性育种、回复突变子的应用等) 截流或减少终产物堆积 (如借助营养缺陷型或采用渗漏缺陷型等) 移去终产物 (借助膜透性的突变等),4.5 抗反馈调节突变株的选育,回复突变引起的抗反馈调节突变株 耐自身产物突变株选育 抗终产物结构类似物突变株的选育 累积前体和

14、耐前体突变株的选育,4.5 抗反馈调节突变株的选育,1. 概念：一种可逆性突变，即具有突变型基因的个体通过再突变又成为野生型表型的过程。 2. 产生的原因 (1) 原有基因的回复突变：指基因内部位点突变引起的逆向突变现象，分以下两种情况： 同一基因内的同一个或几个碱基的突变引起的回复，消除了原有突变效应，完全恢复野生基因型及其功能，即真正的回复突变； 在同一基因内，但不同的位点碱基的变化，改变了基因的核苷酸序列，补偿了原有突变点已失去的功能，使其出现野生表型，称为基因内抑制突变。,4.5.1 回复突变引起的抗反馈调节突变株,(2) 非原有基因的回复突变 概念：在DNA分子链上的一个基因突变成为

15、突变型，随后在邻近的基因某位点碱基发生突变，抑制了前一个突变基因的效应，重新出现野生型的表型，又称为抑制基因突变。,4.5.1 回复突变引起的抗反馈调节突变株,2. 产生的原因,区别基因回复突变和抑制基因突变的方法 将回复突变菌株和野生型菌株进行回交试验或杂交重组试验，观察它们的子代是否有突变型出现： 有同样的突变型重新出现，说明回复突变和原来突变型不在同一位置而是分开的，属于抑制基因回复突变株； 如果杂交后代没有产生突变型，表明回复突变的位置与原突变型位点相同，是真正的回复突变。,4.5.1 回复突变引起的抗反馈调节突变株,3. 回复突变引起的抗反馈调节突变株的筛选 (1) 初级代谢途径障碍

16、性回复突变型 采用回复突变方法来筛选抗反馈调节突变株是根据“原养型营缺型原养型”选育途径进行的。二次突变后的情况有以下两种： 一种是在原位点发生回复突变，恢复野生型酶活力； 另一种是在原突变位点以外位置回复突变。这种回复突变体的表型虽然与原养型相似，但基因型不同，它并不是原有结构基因的恢复，而是反馈调节变构酶的调节中心发生突变造成。突变后的调节中心与活性中心相互影响，催化位点得以恢复酶活力，由于调节位点已发生突变，它不能再和阻遏物结合，因此，回复突变解除了反馈调节机制，使有效代谢产物大量累积。,4.5.1 回复突变引起的抗反馈调节突变株,(2) 次级代谢途径障碍性的回复突变 次级代谢回复突变，是一种初级代谢途径或次级代谢途径障碍性回复突变型。例如金霉素回复突变就是利用“原养型营缺型原养型”选育途径进行的，获得了增产。