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1、第一节 微生物原生质体育种,原生质体： 1953年首次用巨大芽孢杆菌制备成功 1955年发现再生方法,微生物原生质体的特点： 对渗透压特别敏感 对诱变剂的诱变效应更敏感 失去对噬菌体的敏感性 不受感受态的影响,第一节 微生物原生质体育种,一、原生质体再生育种 二、 诱变育种 三、 转化育种 四、 融合育种 五、其他微生物原生质体育种,一、原生质体再生育种 ： 微生物制备原生质体后直接再生， 从再生菌落中分离筛选变异株， 最终得到优良性状提高的正变菌株,原生质体再生育种正变率高于常规育种？ 制备和再生过程中相关因素 微生物组成和结构改变 一般选用对数期细胞制备原生质体 不需要加遗传标记,第一节
2、微生物原生质体育种,一、原生质体再生育种,出发菌株选择,菌种活化和预培养,原生质体制备,原生质体再生,高产菌株分离,二、原生质体诱变育种 微生物制备原生质体后诱变处理，分离到再生培养基中再生，从再生菌落中分离筛选高产正变菌株,二、原生质体诱变育种 操作：物理诱变剂 化学诱变剂 特点：操作繁琐、技术要求高 再生时间长、容易染菌 P223 扩展青霉PF-868原生质体诱变,第一节 微生物原生质体育种,三、原生质体转化育种 何种形式DNA转化率高？ 质粒,第一节 微生物原生质体育种,五、其他微生物原生质体育种 脂质体转移 原生质体转染等,第二节 微生物原生质体融合育种,微生物原生质体融合育种： 通过
3、人为方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并产生重组子的过程。 聚乙二醇诱导 电场 诱导,微生物原生质体融合育种的优点？ 1、大幅度提高亲本间重组频率 2、扩大重组的亲本范围 3、集中双亲本优良性状机会更大,第二节 微生物原生质体融合育种,微生物原生质体融合 育种程序（见图9.2）,14,原生质体融合技术的一般步骤,融合亲本的选择与标记； 原生质体的制备； 原生质体的融合； 原生质体的再生； 融合子的选择与鉴定； 目标菌株的筛选。,一、直接亲本及其遗传标记的选择 1.营养缺陷型、抗性标记、热致死 孢子颜色、菌落形态等 注意：多数营养缺陷型菌株会影响代谢产物的产量 2.常把一方灭活后再
4、融合 3. 可用不同荧光标记直接亲本,3. 可用不同荧光标记直接亲本,提取拟南芥叶片的原生质体， 并转化带有GFP标签的目的 蛋白表达载体，瞬时表达观察 目的蛋白在亚细胞中的定位情况 红色为叶绿体自发荧光 绿色为GFP的荧光。,二、原生质体制备与再生 制备过程：分离、收集、纯化、活性鉴定、保存 去壁方法：1.机械法2.非酶分离法3.酶法 酶法分离原生质体：参考图9.3,第二节 微生物原生质体融合育种,酶法分离原生质体的影响因素？ （1）培养基组成 放线菌 加入亚适量甘氨酸 黑曲霉,第二节 微生物原生质体融合育种,酶法分离原生质体的影响因素？ （2）菌体培养方式： 1.平板玻璃纸法： 丝状菌 2
5、.振荡沉没培养法 细菌和酵母菌,酶法分离原生质体的影响因素？ （3）菌体年龄 丝状真菌 菌丝体尖端细胞 放线菌 对数期到静止期 细菌 对数期 酵母菌 菌体同步化,酶法分离原生质体的影响因素？ （4）稳定剂 高渗溶液 无机盐：NaCl、KCl、MgSO4、CaCl2 有机物：蔗糖、甘露醇、山梨醇 丝状真菌 无机盐 细菌 蔗糖、氯化钠 稳定剂常用浓度：0.31mol/L,（）酶解前的预处理 加入某种物质，抑制或阻止细胞壁某种成分合成 酵母菌、丝状真菌 巯基乙醇 酵母菌 EDTA 放线菌 甘氨酸 细菌 亚适量青霉素,酶法分离原生质体的影响因素？ （）酶系和酶的浓度 细菌、放线菌 溶菌酶 真菌 蜗牛酶
6、 注意事项：,酶法分离原生质体的影响因素？ （）酶的作用温度和值 酶的最适温度、菌株生长最适温度 （）菌体密度,酶法分离原生质体的影响因素？ （）酶解方式 使用培养皿分离效果好 分离时保持良好的通气条件、适当振荡 分离条件经试验可确定 如计算测定原生质体形成率,第七节 微生物原生质体融合育种,如何计算测定原生质体形成率？ 原生质体形成率=（A-B）/A100% 细菌、酵母菌 血球计数板计数法 高渗再生培养基培养法 霉菌、放线菌 高渗再生培养基培养法,二、原生质体制备与再生 原生质体的鉴定 （）低渗爆破法 p233 （）荧光染色法 荧光增白剂 荧光显微镜,二、原生质体制备与再生 原生质体的收集和
7、纯化 （）过滤法 适于丝状微生物 （）密度梯度离心法 离心后，原生质体上浮 （）界面法 离心后，原生质体在界面 （）漂浮法 适于细胞较大的微生物,二、原生质体制备与再生 原生质体的活力测定 （）荧光素双醋酸盐染色法 （）酚藏花红染色法 （）伊文思蓝染色法,二、原生质体制备与再生 原生质体的保存 液氮冷藏 加入保护剂，如：二甲亚砜、甘油等,二、原生质体制备与再生 原生质体的再生： 在高渗再生培养基上，原生质体重新 合成细胞壁，恢复成完整细胞。 参见p234 图9.4,1.原生质体再生的影响因素（234） 菌体生理状态 稳定剂 酶浓度和作用时间 再生培养基组成 残存菌体的分离 ； 再生培养基上冷凝
8、水 原生质体密度、再生方法,二、原生质体制备与再生 再生率及其计算 p236 目的：找出最佳的原生质体制备 和再生条件 再生频率（%）=（C-B）/（A-B） 100%,三、原生质体融合 （一）原生质体融合过程 P236 （二）原生质体融合的影响因素 、融合剂 、温度 、亲株的亲和力和原生质体的活性 、无机离子,（二）原生质体融合的影响因素 、融合剂 化学融合剂：PEG 不同微生物适合不同相对分子质量的 PEG 真菌 4000-6000 细菌 1500-6000 物理融合剂：电场、激光,（二）原生质体融合的影响因素 、融合剂 电场融合的优点： 适于动植物、微生物细胞；融合频率高 可在显微镜下观
9、察,（二）原生质体融合的影响因素 、融合剂 、温度 2030 、亲株的亲和力和原生质体的活性 、无机离子 PEG介导融合 钙离子、镁离子 电场融合 糖或糖醇,四、融合体再生 复原： 再生培养基 细胞壁重建 形成菌落 P239 图9.8,四、融合体再生 （二）融合体的检出和分离 利用营养缺陷型标记选择融合体 利用抗药性 用灭活原生质体 利用荧光染色法 双亲对碳源利用不同,四、融合体再生 （二）融合体的检出和分离 1.利用营养缺陷型标记选择融合体 双亲原生质体的融合体形成菌落 亲本不能在基本培养基上生长 生产育种不常用，可用于遗传研究,（二）融合体的检出和分离 2.利用抗药性选择融合体 营养缺陷型
10、和抗药性结合筛选P240,（二）融合体的检出和分离 3.用灭活原生质体检出融合体 灭活方法： 药物 紫外线 温度,（二）融合体的检出和分离 4.利用荧光染色法 亲本分别带上不同颜色荧光 融合后直接根据荧光颜色选出融合体 注意事项：,四、融合体再生 （二）融合体的检出和分离 观察形态 生化指标测定 DNA含量：分光光度计,五、融合重组体检出与遗传特性分析 （一）重组体的检出和鉴别方法 1、直接法 图9.9 2、间接选择法 图9.10 3、钝化选择法（灭活一方原生质体）,五、融合重组体检出与遗传特性分析 （二）融合率 见表9.2,五、融合重组体检出与遗传特性分析 （三）DNA含量及孢子形态测定 1
11、、DNA含量测定 2、单倍化 3、酶活性及孢子体积测定 4、分子生物学方法,六、原生质体融合的应用 1、提高产量或质量，合成新物质 2、改良菌种遗传特性 3、优化菌种发酵特性 4、质粒转移 5、原生质体与细胞核融合 6、进行遗传分析,第三节 细菌原生质体融合育种 细菌细胞壁如何降解？P247,第三节 细菌原生质体融合育种 1.如何提高细菌原生质体制备率和再生率？ （1）预处理：目的改变细胞壁的性质 （2）溶菌酶： （3）细菌生理状态：对数期 （4）培养基和培养条件：,第三节 细菌原生质体融合育种 2.建立最佳融合体系 PEG 相对分子质量：40006000 浓 度：40%50% 融合时间：30
12、min,第三节 细菌原生质体融合育种 （三）操作方法 p251 斜面活化两代 液体振荡培养,第四节 放线菌原生质体融合育种 （二）菌体培养及预处理 水解酶：溶菌酶 预处理：加甘氨酸,第五节 酵母菌原生质体融合育种 一、酵母细胞壁结构和遗传标记 菌龄对原生质体形成影响大 亲本灭火的方法：紫外线 热 药物,第五节 酵母菌原生质体融合育种 一、酵母原生质体制备 p259 预处理：EDTA；巯基乙醇 蜗牛酶,第六节 霉菌原生质体融合育种 二、培养基及相关溶液 p262 （1）查氏培养基的作用：菌丝生长 （3）酶液的制备：,第六节 霉菌原生质体融合育种 三、霉菌原生质体融合的关键步骤 p262 （一）原生质体制备 1、水解酶的选择 2、菌丝的制备：常用玻璃纸法,
