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1、,微生物包括,原核生物,原生生物(藻类、原生动物),真菌,病毒,课题2 微生物的培养与应用,是一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称,微生物的共同特点 （小、多、快、强、广）,（1）体积小，面积大 （细胞以微米、纳米来计算） （2）吸收多，转化快 （3）生长旺，繁殖快 如大肠杆菌 （4）适应强，易变异 如感冒病毒 （5）分布广，种类多,变酸？,巴斯德,法国，微生物学家,失败的原因：发酵物中混入了杂菌,课题1 微生物的实验室培养,了解有关培养基的基础知识，无菌技术的操作，进行微生物的培养。,一.学习目标,无菌技术的操作。,二.课题重难点,1.何为培养基？,3.各种培养基的具体配方不同，但其基本
2、成分都相同，都包括哪些营养成分？,自主学习:,2.按照物理形态、化学成分、用途分，培养基的种类有哪些？,一.基础知识,(一)培养基,人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。,(一)培养基,1.概念：,2.类型及应用：,液体培养基 固体培养基,据物理性质分,天然培养基 合成培养基,据化学成分分,选择培养基 鉴别培养基,据用途分,2.类型及应用：,(一)培养基,常用于工业生产,用于微生物的分离、鉴定、计数,加琼脂,常用于工业生产,常用于分类、鉴定,培养、分离出特定微生物,鉴别不同种类的微生物,在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长
3、。,根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成。,练习,下列有关培养基的叙述正确的是（ ） A.培养基是为微生物的生长繁殖提供营养的基质 B.培养基只有两类：固体培养基和液体培养基 C.固体培养基中加入少量水即可制成液体培养基 D.微生物在固体培养基上生长时，可以形成肉眼可见的单个细菌,A,碳源,氮源,无机盐,水,(一)培养基,3.营养要素,还需满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。,如:生长因子(即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、碱基),培养基的主要成分,牛肉膏蛋白胨培养基配方,牛肉膏 5.0g 蛋白胨 10.0g NaCl 5.
4、0g 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1000ml。,配方中的各成分为微生物提供了哪些营养？,(一)培养基,3.营养要素：,碳源、氮源、 磷酸盐和维生素,氮源和维生素,无机盐,H、O,对异养微生物来说，含C、N的化合物既是碳源，也是氮源。即有些化合物作为营养要素成分时并非单一方面的作用。 并非所有微生物都需添加特殊营养物质,下列叙述错误的是（ ） A.培养乳酸菌时需要在培养基中添加维生素 B.培养霉菌时需将培养基中的pH调至碱性 C.培养细菌时需将pH调至中性或微碱性 D.培养厌氧微生物时则需要提供无氧的条件,B,练习,1、何为无菌技术？无菌技术包括哪些方面？ 2、消毒和灭菌的区别？ 3、常用
5、的消毒方法有哪些？ 4、常用的灭菌方法有哪些？,自主学习：,(二)无菌技术,1.获得纯净培养物的关键：,防止外来杂菌的入侵,2.无菌技术包括：4方面,对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒； 用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌； 为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行； 实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围物品接触。,(二)无菌技术,P15思考题,练习,下列操作与无菌技术无关的是（ ） A.接种前用肥皂洗双手，再用酒精擦拭双手 B.接种前用火焰烧灼接种针 C.培养基在50 左右时搁置斜面 D.在酒精灯火焰旁边完成,C,消毒 使用较为温和的
6、物理或化学方法，杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)。,3.消毒与灭菌,灭菌,使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。,理化因素的作用强度,消灭微生物的数量,芽孢和孢子能否被消灭,(1)定义,1、煮沸消毒法: 100煮沸5-6min，日常生活中广泛应用 2、巴氏消毒法： 70-75 煮30min或80煮15min，牛奶、啤酒等不宜进行高温消毒的 3、化学药剂消毒法: 75%酒精、氯气、石炭酸、煤酚皂溶液等 4、紫外线消毒法： 用于接种室空气消毒 ,(2)消毒的方法：,3.消毒与灭菌,1、灼烧灭菌： 用于微生物接种工具，如：接种环、接种针或其他金属用具等，及接种
7、过程中试管口或锥形瓶口的灭菌,(3)灭菌的方法：,3.消毒与灭菌,2、干热灭菌： 160-170 下加热1-2h。 用于玻璃器皿、金属用具等能耐高温、需保持干燥的物品。 3、高压蒸气灭菌： 100kPa、121 下维持 15-30min. 广泛用于培养基及多种器材、物品。,(3)灭菌的方法：,3.消毒与灭菌,P16 请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。 （1） 培养细菌用的培养基与培养皿 （2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管 （3） 实验操作者的双手,答：（1）（2）需要灭菌；（3）需要消毒。,旁栏思考,练习,细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、酒精、火焰灼烧等几种不
8、同的处理方法，这些方法依次用于杀灭哪些部位的杂菌（ ） A.接种针、手、培养基 B.高压锅、手、接种针 C.培养基、手、接种针 D.培养基、手、高压锅,C,变形题,培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手、空气、牛奶所采用的灭菌、消毒方法依次是（ ） 化学消毒 灼烧灭菌 干热灭菌 紫外线消毒 高压蒸汽灭菌 巴氏消毒法 A. B. C. D. ,A,练习,外科手术器械和罐头食品的处理，要以能够杀死什么为标准（ ） A.球菌 B.杆菌 C.弧菌 D.芽孢,D,练习,微生物培养过程中，肉眼鉴别金黄色葡萄球菌和枯草杆菌的重要依据是（ ） A.细菌的大小、形状、颜色 B.菌落的大小、形状、颜色 C.有无
9、鞭毛 D.培养基的不同,B,关于微生物营养物质的叙述中，正确的是（ ） A.是碳源的物质不可能同时是氮源 B.凡碳源都提供能量 C.除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量,D,练习,规律：对异养微生物来说，含C、H、O、N的 化合物既是微生物的碳源，又是氮源； 有机碳源能提供能量，无机碳源不能提供能量； 无机物也可提供碳源、氮源和能源。,下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是 A、防止杂菌污染 B、消灭杂菌 C、培养基和发酵设备都必须灭菌 D、灭菌必须在接种前,B,二、实验操作,(一)制备牛肉膏蛋白胨培养基(用于培养细菌),1计算、称量 2溶化 3调pH： pH76 4过滤：这一
10、步可以省去。 5分装：分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。 6加塞 7包扎,操作步骤,8灭菌: 将50ml培养基用玻棒转移至三角锥瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸，再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121，灭菌1530min。将培养皿用旧报纸包裹，放入干热灭菌箱内，在160170 下灭菌2h。,9倒平板: 待培养基冷却到50 左右时，在酒精灯附近倒平板。 10无菌检查： 将灭菌的培养基放入37的温室中培养2448小时，以检查灭菌是否彻底。,倒平板技术,1.将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培
11、养基的锥形瓶，左手拨出棉塞。,1,2,3,4,倒平板技术,2.右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰。,1,2,3,4,倒平板技术,1,2,3,4,3.用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基(约10 20mL)倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。,倒平板技术,1,2,3,4,4.等待平板冷却凝固，大约需510min。然后，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上。,1.培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？,答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。,问题讨论,2.为
12、什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？,答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。,3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？,答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。,（二）纯化大肠杆菌,接种方法有： 平板划线法和稀释涂布平板法,微生物的接种技术：,平板划线的操作方法,5,1,2,3,4,
13、一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的； 二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。,一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的； 二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。,一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的； 二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。,问题讨论,1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种
14、环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,答：以免接种环温度太高，杀死菌种。,3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能
15、得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,稀释涂布平板法,稀释,1.将分别盛有9mL水的6支试管灭菌，并按101106的顺序编号。,2.用移液管吸取1mL培养的菌液，注入第一支试管中。用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，使菌液与水充分混匀。,3.从101倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注入102倍稀释的试管中，重复第2步的操作。依次类推，直到完成最后一支试管的稀释。,注意： 移液管需要经过灭菌。操作时，试管口和移液管离火焰12cm处.,涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？,应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。,问题讨论,菌种的保存,1.临时保藏： 接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4冰箱保存。 2.长期保存： 甘油冷冻管藏法,四、课题成果评价,（一）培养基的制作是否合格 如果未接种的培养基在恒温箱中保温12 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。,（二）接种操作是否符合无菌要求 如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。,（三
