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1、第四章,抗体制药,本章主要内容,第一节 概述 第二节 单克隆抗体 第三节 鼠源性单克隆抗体的改造 第四节 基因工程抗体和抗体工程 第五节 抗体诊断药物 第六节 抗体治疗药物,第一节 概述,抗体是能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。 它是机体免疫系统受到抗原物质刺激后，B淋巴细胞被活化、增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的球蛋白。,血清蛋白分为白蛋白、甲种()球蛋白、乙种()球蛋白和丙种()球蛋白 抗体活性存在于丙种球蛋白组分. 将具有抗体活性及化学结构与抗体相似的球蛋白统称为免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig),Ig结构,Ig结构,可变区,恒定区 异种抗原性,由于病原
2、微生物是具有多种抗原决定簇的抗原物质，因此这些抗体制剂也是多种抗体的混合物，称为多克隆抗体，即针对多种抗原决定簇的抗体。它们在应用过程中经常会出现非特异性交叉反应。,第二节 单克隆抗体,单克隆抗体是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。这种抗体是针对一个抗原决定簇的抗体，又是由单一的B淋巴细胞克隆产生的，故称为单克隆抗体。,单克隆抗体和多克隆抗体,免疫学知识:,人体和动物都有免疫系统，包括特异性免疫和非特异性免疫。,宿主的屏障; 吞噬细胞; 正常组织和体液中的抗菌物质; 炎症反应.,非特异性免疫,皮肤; 黏膜; 血
3、脑屏障：由介于血循环与脑实质间的软脑膜、脉络丛的脑毛细血管壁和包于壁外的胶质膜所组成，能阻挡病原生物和其他大分子物质由血循环进入脑组织和脑室。 ; 血胎屏障：由介于胎盘和母体血循环之间的子宫内膜基蜕膜和胎儿的绒毛膜滋养层细胞所组成，可阻挡母体内有害物质进入胎儿体内 。,抗原性物质,抗原被分解,包涵体,溶菌酶进入包涵体,抗原碎片,吞噬作用,不直接杀死病原体，但能配合免疫细胞、抗体或其他防御因子使它们发挥较强的免疫功能，如补体、干扰素。,存在于红细胞、白细胞和血小板等细胞和组织中的组胺和5-羟色胺在机体感染病原体而引起炎症反应时，可使炎症部位的毛细血管迅速扩张，血流量增加，毛细血管通透性增强，大量
4、淋巴细胞从毛细血管穿越进入炎症区。,特异性免疫：当机体受到抗原刺激时，体内的抗原特异性淋巴细胞识别抗原，然后被活化，发生一系列的增殖和分化等变化，最终表现出一定的细胞免疫或体液免疫。 特异性免疫又分为体液免疫和细胞免疫。,细胞免疫主要是指机体受到异己物质抗原的刺激后，一类小淋巴细胞依赖胸腺的T细胞发生增生，分化，直接攻击靶细胞或间接地释放一些淋巴因子从而使机体达到免疫的过程。,体液免疫是当机体受到抗原刺激后，来源于骨髓的小淋巴细胞B淋巴细胞进行增生和分化为浆细胞，进而合成各种免疫球蛋白（抗体），然后在体液中发挥免疫作用的过程。,第三节 鼠源性单克隆抗体的改造,最初制备的单克隆抗体都是鼠源性的，
5、大量应用于人体时可产生人抗鼠抗体，使其作用和效果都受到严重影响，甚至有毒副作用。,Ig结构,可变区,恒定区 异种抗原性,改造目的,改造鼠源性单克隆抗体的目的有两个： 1、一是降低免疫原性； 2、二是降低相对分子量，增加组织穿透能力。,一、人-鼠嵌合抗体,抗体同抗原结合的功能取决于抗体分子的可变区，同种性免疫原性则决定于抗体分子的稳定区。 人-鼠嵌合抗体：鼠源性单克隆抗体的可变区基因和人免疫球蛋白的稳定区基因连接起来，再共转染骨髓瘤细胞，就可表达出完整的人-鼠嵌合抗体。,二、改形抗体,用鼠源性单克隆抗体的互补决定区序列替换人免疫球蛋白分子中的互补决定区序列，则可使人的免疫球蛋白分子具有鼠源性单克
6、隆抗体的抗原结合特异性。由于抗体分子中鼠源部分只占很小比例，可基本消除免疫原性。最大问题是抗体的亲和力下降，甚至丧失活性。,三、小分子抗体,基因工程的小分子抗体仅表达鼠源性单克隆抗体的可变区，其相对分子量仅为原抗体的八十分之一到三分之一。,正在研制的小分子抗体,1、Fab片段抗体，由完整的轻链L和重链的可变区加部分恒定区(VH+CH1)； 2、FV抗体，VH和VL组成； 3、单链抗体（SCFV），由 VH和VL 通过一段连接肽连接而成的重组蛋白； 4、单域抗体，由重链的或轻链的单个可变区（ VH或VL ）组成； 5、最小识别单位，由互补决定区构成。,优点,单链抗体的优点,1、分子小，容易渗透到
7、组织中（包括肿瘤），增加有效药物浓度； 2、单链易于进行分子改造，如与毒素拼接； 3、免疫原性小，体内半衰期短。 缺点：稳定性较低；功能单一；亲和力低，稳定性差，体内清除过快。,四、双功能抗体,就是双特异性单链抗体：将抗A抗原抗体的轻链可变区(VLA)与抗B抗原抗体的轻链可变区(VLB) 通过短肽连接构成的双链抗体。 结合抗原的两个臂具有不同的特异性。,双功能抗体的优点,一个臂识别肿瘤细胞表面抗原，包括肿瘤相关抗原、癌基因产物、特殊的白细胞分化抗原、病毒蛋白抗原、特异性受体等，并有效结合；另一个臂可识别免疫效应细胞及分子,如CD3(T细胞识别抗原的单位）、毒素、药物等。,五、抗体融合蛋白,构建
8、抗体融合蛋白的原则：将第一个蛋白的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白基因，即可实现两个基因的共表达。 抗体酶，酶-抗体型融合蛋白，在药物治疗中有广阔的前景，它可在靶向位置上将前体药物转化成有效的药物，从而避免了对正常组织的损害。,第四节 基因工程抗体和抗体工程,抗体研究的三大阶段：多克隆抗体；单克隆抗体；以基因工程方法制备抗体。 基因工程抗体：不用人工免疫动物和细胞融合技术，完全用基因工程技术制备人源性抗体，而且还能利用基因转移和表达技术，通过细菌发酵或转基因动物、植物大规模生产抗体。,1、获取目的基因：RNA反转录PCR获取抗体某一特定基因区段； 2、载体：噬菌粒； 3、淘筛：
9、抗原固相化后，对噬菌粒群吸附、洗涤和洗脱，再感染扩增，如此反复； 4、表达与鉴定：鉴定目的基因，导入感受态菌株，表达 原核细胞、真核细胞、转基因植物和 动物等表达方式。,基因工程抗体的表达,原核生物 融合表达和分泌表达 真核生物 都是分泌表达 转基因植物 烟草 转基因动物 单基因水平。,第五节 抗体诊断药物,抗原和抗体的特异性结合在体内和体外都可呈现某种反应。在体外可发生凝集或沉淀等反应，可用已知抗体来鉴定抗原，作病原学的诊断和血型测定，称为血清学鉴定。 在体内，可表现为溶菌、杀菌、促进吞噬或中和毒素等作用，故可治疗，即抗体治疗药物。,三大类抗体诊断药物：,一、血清学鉴定用的抗体试剂 二、免疫
10、标记用的抗体试剂 三、体内导向诊断药物,一、血清学鉴定用的抗体试剂,血清学鉴定是指用已知抗体来鉴定未知的抗原型，主要用于疾病的病原菌的诊断和血型鉴定，常用凝集反应。,1、鉴定病原菌的抗体试剂,（1）常用品种和用途： 诊断血清、分群血清、分型血清、因子血清等。 （2）诊断血清的制备：制备细菌抗原，免疫动物和制备抗体血清。 （3）诊断方法：直接凝集反应。,2、乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg） 的反向被动血凝诊断试剂,制备方法，红细胞经甲醛处理后，在酸性条件下能吸附蛋白质，当纯化的抗乙肝病毒血清吸附其上时便具有抗体活性，若待测样品中有乙型肝炎病毒表面抗原时，则发生特异性结合反应而使血细胞发生凝集。
11、,3、抗ABO血型系统血清,ABO血型抗血清的制备： 人源性ABO血型抗血清是采集健康献血人的血液，凝固后，置4度过夜，使冷抗体吸附在血块上,分离血清制备抗体。,二、免疫标记用的抗体试剂,放射性、荧光或酶标记后将抗原和抗体反应放大，提高反应的敏感性，可对微量抗原物质进行定性或定量检测。结合显微技术，可定位测定。,1、荧光抗体诊断试剂 用荧光色素标记抗体，当抗原与抗体反应时可发光。,2、免疫酶抗体诊断试剂 用酶标记抗体来检测抗原，有免疫酶染法和酶免疫测定。,3、放射免疫用抗体诊断试剂 把放射性核素分析的高度灵敏度与抗原抗体反应的特异性结合。,三、体内导向诊断药物,以抗体为载体的导向诊断药物的研究
12、比导向治疗更接近临床应用阶段。 放射性免疫显像的优点：在体内有确切定位肿瘤的作用；在体内可检出0.5厘米大小的病灶；小分子抗体容易到达肿瘤部位；抗体在肿瘤部位可保留6-9日；能观察抗体在血中的半衰期和可能出现的不良反应。,第六节 抗体治疗药物,以抗体为载体的导向治疗药物的研究已有近20年的历史，已制备出百余种单克隆抗体，鉴定出数十种与肿瘤相关的抗原，但治疗试剂还没有达到商品化。 致力于抗体小型化和人源化研究。,一、放射性核素标记的抗体治疗药物,抗体作为放射性核素的导向载体，操作简单、用量小，且能观察到药物在体内的分布和药物动力学，放射性标记的抗体有较大的杀伤范围，有利于克服肿瘤表面抗原的异质性，对肿瘤细胞的杀伤也不依赖抗原抗体结合后的吸收作用，由于分子量小，容易穿透到达肿瘤部位。,二、抗癌药物偶联的抗体药物,常用抗癌药如氨甲喋呤、阿霉素、丝裂霉素、环磷酰胺等，以人血清白蛋白为中间载体，可明显提高每分子抗体所携带的氨甲喋呤量，使体外细胞毒性提高2倍。,
