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1、第十五章 甾体激素类药物的分析 The analysis of Steroid Hormon Drugs,刘红菊,基本结构：环戊烷骈多氢菲,4,5,6,7,第一节 基本结构与分类,4,1,4,5,5(10),环上双键的表示方法 双键位置,环上取代基构型表示方法,与母核相连的基团在环平面之后的，用虚线表示 ，称为构型。 在环平面之前用的实线表示，称为构型。,构型,构型,11,17,4-3-酮,分类,甾体激素,肾上腺皮质激素,性激素,雄性激素及蛋白同化激素,孕激素,雌激素,皮质酮的衍生物,1肾上腺皮质激素,皮质酮,11,-醇酮基,4-3-酮,天然的皮质激素,氢化可的松 Hydrocortisone
2、,可的松 Cortisone,地塞米松 dexamethason,合成的皮质激素,醋酸地塞米松,合成的皮质激素,地塞米松磷酸钠,醋酸曲安奈德,结构特点：,A环：脂肪环，具有4-3-酮结构。 17位：-醇酮基。 11位：羟基、羰基等。 9位引入卤素,2.雄性激素及蛋白同化激素,睾酮的衍生物,睾 酮 Testosterone,丙酸睾酮,雄性激素代表药物,苯丙酸诺龙,蛋白同化激素,结构特点：,A环：4-3-酮； 17位：羟基、酯,可供分析的官能团： A环：4-3-酮,黄体酮 Progesterone,3.孕 激 素,甲酮基,醋酸甲地孕酮,乙酰氧基,A环有4-3-酮结构； 第10位无甲基； 第17位有
3、羟基和乙炔基。,炔诺酮,A环的4-3-酮 17位上的甲酮基或乙炔基,可供分析官能团：,米非司酮,显碱性，可用非水溶液滴定法测定含量,4.雌 激 素,炔雌醇 Ethinylestradiol,雌二醇 Estradiol,A,A环的酚羟基 C17 乙炔基,可供分析的官能团：,小 结,第二节 理化性质和鉴别试验,性状特征 化学鉴别法 紫外分光光度法,红外分光光度法 薄层色谱法 高效液相色谱法,一、性状特征,1.性状与溶解度：白色至微黄色粉末或结晶性粉末。在水中不溶，多数溶解于甲醇、氯仿等有机溶剂。 2.熔点： 纯度、鉴定；第一法 3.比旋度 4.吸收系数,二、化学鉴别法,（一）与强酸的呈色反应（母核
4、）,甾体激素类药物,呈色,H2SO4 H3PO4 HClO4 HCl 硫酸-乙醇（甲醇）,与硫酸显色反应,药物 显 色 荧光 加水稀释,泼尼松龙 深红 絮状 灰,炔雌醇 橙红 黄绿 絮状玫红,醋酸可的松 黄或微 褪色并澄清 带橙色,氢化可的松 鉴别,取本品约2mg ，加硫酸2ml 使溶解，放置5 分钟，显棕黄色至红色，并显绿色荧光；将此溶液倾入10ml水中，即变成黄色至橙黄色，并微带绿色荧光，同时生成少量絮状沉淀。,用途,化学鉴别 薄层色谱的显色剂 例如： “雌二醇缓释贴片”用硫酸无水乙醇（1：1）为显色剂,(二) 官能团的反应,1. C17 醇酮基,肾上腺皮质激素类药物的特征反应。,具有还原
5、性,肾上腺皮质激素 有色甲臜,肾上腺皮质激素 Ag,肾上腺皮质激素 Cu2O,碱性酒石酸铜,氨制硝酸银,formazan,醋酸泼尼松 鉴别,取本品约1mg ，加乙醇2ml 使溶解，加10氢氧化钠溶液2 滴与氯化三苯四氮唑试液1ml ，即显红色。,甾酮类激素药物,呈色,羰基试剂 酸性,2. C3酮基和C20酮基,反应通式,常用的羰基试剂： 羟胺、苯肼、2,4-二硝基苯肼、异烟肼、氨基脲等。,羟胺,肟,苯肼,苯腙,氨基脲,缩氨基脲,异烟腙（黄色）,睾酮,黄体酮,异烟双腙（黄色）,氢化可的松 鉴别,取本品约0.1mg，加甲醇1ml 溶解后，加新制的硫酸苯肼试液8ml ，在70加热15分钟，即显黄色。
6、,黄体酮,蓝紫色,亚硝基铁 氰化钠,其他甾体,淡橙色 或不显色,3.甲酮基,孕激素（黄体酮）的特征反应,黄体酮,蓝紫色,黄体酮 鉴别,取本品约5mg ，置小试管中，加甲醇0.2ml 溶解后，加亚硝基铁氰化钠的细粉约3mg 、碳酸钠及醋酸铵各约50mg，摇匀，放置1030分钟，应显蓝紫色。,4.活泼亚甲基反应,羰基邻位的亚甲基叫活泼亚甲基。 C3、C11、C20 C2、C12、C21 有立体障碍，不反应,可的松,C17 羰基 可反应的活泼亚甲基：C16,雌酮,活泼亚甲基反应,雌酮,间硝基苯,雌激素,红色偶 氮染料,重氮苯磺酸,5. 酚羟基,雌激素专属反应,（偶合）,雌激素,FeCl3,有色络和物
7、,雌二醇【鉴别】,【鉴别】取本品约2mg，加硫酸2ml溶解，有黄绿色荧光，加三氯化铁试液2滴，呈草绿色，再加水稀释，则变为红色。,6. 乙炔基,白色,炔诺酮,【鉴别】（1)取本品约l0mg，加乙醇lml溶解后，加硝酸银试液5-6滴，即生成白色沉淀。,有机氟,氟,7. 有机卤素,氧瓶燃烧,环-氯,氯,Cl,白色沉淀,硝酸,硝酸银,侧链-氯,加热,丙酸倍氯米松 鉴别,取本品约25mg，照氧瓶燃烧法（附录 C）进行有机破坏，以水20 ml与0.4氢氧化钠溶液1ml为吸收液，燃烧完全后，溶液显氯化物的鉴别反应。,环-氯,丙酸氯倍他索 鉴别,取本品少许，加乙醇1ml ，混合，置水浴上加热2 分钟，加硝酸
8、(1 2)2ml ，摇匀，加硝酸银试液数滴，即显白色沉淀。,侧链-氯,8. 酯的反应 C17或C21位上羟基的酯，水解产生相应的羧酸，再根据羧酸的性质进行鉴别。 如：,香,特臭,特臭,-3-酮,苯环,四、UV法,中国药典规定雌二醇的紫外鉴别方法： “取含量测定项下溶液，照分光光度法（附录 A）测定，在280 nm 的波长处有最大吸收。”,丙酸倍氯米松 鉴别,取本品，精密称定，加乙醇溶解并定量稀释制成每1ml中含20g 的溶液，照分光光度法（附录 A）测定，在239nm的波长处有最大吸收，吸收度为0.570.60； 在239nm与263nm波长处的吸收度比值应为2.252.45。,3300300
9、0cm-1,30002700cm-1,19001650cm-1,16501450cm-1,五、 IR法,37503300cm-1,醋酸可的松,结构特征：43酮、C20 酮基、 C11 酮基、C17 OH 、醋酸酯,1630cm-1,3420cm-,亚甲基、角甲基吸收带,1750cm-1,1232cm-1,1052cm-1,COH,六、 TLC法,主要用于甾体激素类制剂的鉴别 方法：对照品法 要求供试品溶液所显主斑点的颜色和位置与对照品溶液的主斑点相同。,丙酸睾酮注射液的鉴别,固定相：硅胶GF254 检视方法：254nm紫外灯下检视荧光淬灭的暗斑,七、 HPLC法,主要用于甾体激素类药物制剂的鉴
10、别 方法：对照品法 要求在含量测定项下记录的色谱图中，供试品峰的tR与对照品峰的tR一致。,基本结构：环戊烷骈多氢菲,4,5,6,7,第一节 基本结构与分类,小 结,化学鉴别法 制备衍生物测定熔点 紫外分光光度法,红外分光光度法 薄层色谱法 高效液相色谱法,第二节 鉴别试验,一、化学鉴别法,与强酸的呈色反应 C17 醇酮基：还原性,肾上腺皮质激素 Cu2O,肾上腺皮质激素 Ag,肾上腺皮质激素 有色甲臜,酮基的呈色反应 甲酮基 黄体酮亚硝基铁氰化钠 蓝紫色 活泼次甲基反应 雌酮间硝基苯 紫红色 酚羟基,甾酮类激素,呈色,羰基试剂,雌激素,FeCl3,有色络和物,乙炔基 有机氟,雌激素,红色偶
11、氮染料,重氮苯磺酸,（偶合）,有机氟,有机氯 酯的反应,氧瓶燃烧,环-氯,侧链-氯,加热,第三节 特殊杂质检查,一、有关物质 1.定义 主要包括合成起始物、中间体、副产物及降解产物等。,2. 特点 （1）可能存在多个甾体杂质 （2）结构类似,3.方法 （具有一定分离能力） TLC法 HPLC法,（1）TLC法,对照：自身稀释对照法 判定方法： 规定杂质斑点数目 规定杂质斑点颜色深度,醋酸氟轻松 检查其他甾体,取本品加氯仿-甲醇（9 ：1）制成3.0mg/ml作为供试液，精密量取适量，加氯仿-甲醇（9 ：1）稀释成0.06mg/ml作为对照液；照薄层色谱法，各取5l，分别点于同一硅胶G板上，以氯
12、仿-甲醇（97 : 3）为展开剂，展开后晾干，在105干燥10分钟，放冷，喷以,碱性四氮唑蓝试液，立即检视，供试品溶液如显杂质斑点，不得多于2个，其颜色与对照液的主斑点比较，不得更深。,1,2,特点： （1）简便易行，不需特殊的仪器； （2）不需对照品； （3）只能控制单个杂质的限量； （4）要求杂质与主成分的显色灵敏度接近。,（2）HPLC法,对照：主成分自身对照法 判定方法： 规定杂质峰数目 规定杂质峰面积,取本品适量，精密称定，以无水乙醇为溶剂，配制成每1ml含2mg的溶液（1）与每1ml含0.04mg的溶液（2），分别取溶液（1）和溶液（2）各10l，进样。记录至主成分峰保留时间的2倍
13、。溶液（1）显示的杂质峰数不得超过4个，各杂质峰面积及其总和分别不得大于溶液（2）主峰面积的1/2和3/4。,醋酸甲地孕酮 检查 其他甾体,特点： （1）不需对照品； （2）可以控制杂质的总量；,剧毒,二、硒,来源：合成中用二氧化硒(SeO2)脱氢。 方法和原理：,pH2.00.2,醋酸氟轻松 检查 硒 取本品50mg，照氧瓶燃烧法进行破坏后，将吸收液转移至100ml容量瓶中，用水15ml冲洗燃烧瓶及铂丝，并入吸收液中，用水加至刻度。取硒对照液（0.05g/ml）和上述供试品溶液分别用氨试液调节pH值至2.0 0.2后，转移至分液漏斗中，用水少量分次,洗涤烧杯，洗液并入分液漏斗中，使成60ml
14、，各加盐酸羟胺溶液（12）1ml，摇匀后，立即精密加二氨基萘试液5ml，摇匀，在室温下放置100分钟，精密加环己烷5ml，强烈振摇2min，静置分层，取环己烷脱水后，测A378nm。 规定 A供A对。,三、有机溶剂残留,GC法 甲醇：第二类，限量0.3% 丙酮：第三类，限量0.5%,地塞米松磷酸钠 检查 甲醇和丙酮,精密称取本品0.16g，置10ml量瓶中，精密加0.1%（ml/ml）正丙醇（内标）溶液2ml，加水稀释至刻度，作为供试液；另精密量取甲醇10l(7.9mg)与丙酮100l (79mg)置100ml量瓶中，精密加内标溶液20ml，加水至刻度，作为对照液。照气相色谱法测定，甲醇限量为
15、0.3%，丙酮限量为0.5%。,四、游离磷酸,地塞米松磷酸钠 氢化可的松磷酸钠 倍他米松磷酸钠 氢化泼尼松磷酸钠,磷钼酸比色法（钼蓝法）：,740nm,磷钼酸,地塞米松磷酸钠 检查 游离磷酸,精密称取本品20mg，置25ml量瓶中，加水15ml溶解，精密加钼酸铵硫酸试液2.5ml与1-氨基-2-萘酚-4-磺酸溶液1ml，加水至刻度，摇匀，在20放置3050分钟，照分光光度法，在740nm处测定吸收度，与对照液(0.035mg/ml磷酸二氢钾溶液) 4.0 ml同法处理的吸收度比较，不得更大。,（对照液 0.035mg/ml KH2PO4）,第四节 含量测定,一、HPLC 固定相：C18（ODS） 流动相：甲醇水 或 乙腈水 方法：外标法；内标法，以不同的甾体激素药物为内标。,黄体酮注射液 【含量测定】,色谱条件与系统适用性试验： 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇水(65:35 ) 为流动相；检测波长为254nm 。理论板数按黄体酮峰计算应不低于1000 ，黄体酮峰和内标
