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1、蛋白质的化学,第 四 章,目的与要求：,课时：3,第一节 了解 第二节 掌握 第三节 重点掌握 第四节 重点掌握 第五节 理解，部分掌握，如蛋白质的变性等 第六节 了解 第七节 自学,一、蛋白质是构成生物体的基本成分,分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。 含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80。,第一节 蛋白质是生命的物质基础,二、 蛋白质具有多样性的生物学功能,蛋白质,生物催化,运动、支持,免疫防御,代谢调节,转运、贮存,控制生长和分化,信息接受和传递,组成生物膜,第二节 蛋白质的化学组成,一、蛋白
2、质的元素组成,主要有C、H、O、N和S。 有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘 。,各种蛋白质的含氮量很接均为16。,蛋白质的含量 = 蛋白质含氮量 6.25,二、蛋白质结构的基本单位,（一）氨基酸的结构,R,L-氨基酸的通式,1. 氨基酸都是两性电解质,2.组成蛋白质的氨基酸都是-氨基酸（脯氨酸例外）,3.各种氨基酸的侧链R的结构和性质不同,碳原子,4. 组成蛋白质的氨基酸都是L-氨基酸（甘氨酸例外）,1非极性R基氨基酸, 8种。 2极性不带电荷R基氨基酸, 7种。 3带负电荷的R基氨基酸, 2种 4带正电荷的R基氨基酸，3种,（二）氨基酸的分类 P63,
3、1、非极性疏水氨基酸,“一家写两三本书来”,氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。,氨基酸等电点(pI) 在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。,（三）、氨基酸的两性解离及等电点,pH=pI,pHpI,pHpI,氨基酸的兼性离子,阳离子,阴离子,K1,C,O,O,H,2,N,CH3,K2,Ala+,Ala ,Ala,H,C,Asp+,Asp,Asp,Asp=,C,C,CH2,N +,3,H,O,O,H,举例：,,.紫外吸收,苯丙氨酸：max259nm 酪氨酸：max278nm 色氨酸：max
4、279nm,含有这三种氨基酸的蛋白质在280nm波长下有最大光吸收，可以测定蛋白质的含量。,,.茚三酮的反应,A. 灵敏度0.5-50g/ml B. 氨基酸与茚三酮生成的蓝紫色物质，在570nm测定吸光值 C.脯氨酸、羟脯氨酸与茚三酮生成黄色物质，在440nm处测吸光值,（三）氨基酸的分离与分析,1. 自动氨基酸分析仪 1.蛋白质完全酸水解 2.水解液于PH 2上样于钠型阳离子交换柱 3.用PH 3.5 0.2mol/L柠檬酸钠溶液洗脱 4.用PH 4.25 0.2mol/L柠檬酸钠溶液洗脱 5.分析洗脱谱上各峰的位置和面积，与标准氨基酸图谱比较分析 P66 2. 高效液相色谱 3. 离子交换
5、层析 4. 生物质谱,蛋 白 质 的 分 子 结 构,第 三 节,蛋白质的分子结构包括 一级结构 二级结构 三级结构 四级结构,定义 蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。,一、蛋白质的一级结构,化学键 肽键，有些蛋白质还包括二硫键。,肽键是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键。 二硫键：两个半胱氨酸的-SH通过缩去一份子H2形成 的-S-S-键。,（一）肽键和肽链,+,甘氨酰甘氨酸,肽键,* 肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。,* 肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基。,* 由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽，由更多的氨基酸相连
6、形成的肽称多肽。,N 末端：多肽链中有自由氨基的一端 C 末端：多肽链中有自由羧基的一端 体内多肽和蛋白质生物合成时，是从氨基端开始，延长到羧基端终止。,多肽链有两端,N末端,C末端,牛核糖核酸酶,GSH过氧化物酶,GSH还原酶,NADPH+H+,NADP+,生物活性肽,谷胱甘肽(GSH),,一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。,（三）蛋白质一级结构测定的原理,C末端氨基酸分析,N末端氨基酸分析,N末端氨基酸分析,A.二硝基氟苯（DNFB）法：P70 B.二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl）灵敏度：110-9mol。,C.Edman法（苯异硫氰酸，PITC法）：P71，蛋白质自动分析
7、仪 D.氨肽酶法：肽链外切酶，从多肽链的N-端逐个水解氨基酸。,A.肼解法:,C末端氨基酸分析,B.羧肽酶法：肽链外切酶，从多肽链的C-端逐个水解氨基酸。,大分子多肽氨基酸顺序的确定：裂解 A.化学裂解法：溴化氰裂解法；羟胺NH2OH裂解法 B.酶裂法:胰蛋白酶，胃蛋白酶等,确定肽段在多肽链中的次序：重叠法 P72 利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。 16肽，端H 端 法裂解：ONS PS EOVE RLA HOWT B法裂解：SEO WTON VERL APS HO 重叠法确定序列：HOWTONSEOVERLAPS,分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成
8、,测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基,把肽链水解成片段，分别进行分析,测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法,一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。,蛋白质一级结构测定,按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列,分离编码蛋白质的基因,测定DNA序列,排列出mRNA序列,5.核酸推导法测定蛋白质一级结构,蛋白质链,DNA,mRNA,二、蛋白质的构象,又称为空间结构，立体结构，高级结构，三维构象等。蛋白质分子中原子和基团在三维空间上的排列，分布及肽链的走向。,（一）维持蛋白质构象的化学键,1.氢键 2.疏水
9、键 3.离子键（盐键） 4.范德华引力 5.配位键 6.二硫键,c,c,二硫键,（二）蛋白质的二级结构,定义：蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象。,主要的化学键： 氢键,-螺旋 -折叠 -转角 无规线团,蛋白质二级结构的主要形式,肽键具有部分双键的性质，不能自由旋转。参与肽键的6个原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，称为肽键平面或肽单元 。,1.肽单位,2. -螺旋,结构特点： 右手螺旋 每螺旋圈包含3.6个氨基酸残基 氨基酸侧链伸向螺旋外侧，对-螺旋的形成有一定影响。,3.-折叠,要点： 肽键平面折叠成锯齿状（折纸
10、状）R基团交错位于齿状结构上下方 氢键维持稳定与主链长轴垂直 两条以上肽链并列时，-片层有顺式和反式平行 (4)R-基团太大时，-折叠不易形成,-折叠：顺式和反式中的氢键,4. -折角,无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。,5.无规卷曲,角蛋白中的-螺旋和二硫键,（三）超二级结构-模体,多肽链顺序上相邻的二级结构常常在空间折叠中靠近，彼此相互作用，形成有规则的二级结构聚集体，是蛋白质发挥特定功能的基础。,钙结合蛋白中结合钙离子的模体,锌指结构,纤连蛋白分子的结构域,（四）结构域,在较大的蛋白质分子中，由多肽链上相邻的超二级结构紧密的联系，进一步折叠形成一个或多个相对独立的三维实体
11、，各行使其功能，称为结构域 。,结构域特点：,结构域与分子整体以共价键相连 具有相对独立的空间构象和生物学功能,免疫球蛋白G的立体结构,疏水键、离子键、氢键和 范德华力等。,主要的化学键：次级键,整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。,(五）蛋白质的三级结构,具有三级结构的蛋白质才具有生物学活性，三级结构一旦破坏，蛋白质的生物学功能丧失。,胰岛素分子的三级结构,溶菌酶的三级结构,（六）蛋白质的四级结构,血红蛋白的四级结构,蛋白质结构示意图,视频：蛋白质的折叠,三、蛋白质和多肽合成的基本原理,（二）采用生物技术合成蛋白质,（一）化学合成法的基本原理 1.
12、氨基酸的基团保护：氨基保护、羧基保护、侧链基团保护 2. 多肽的液相合成 P80 3. 多肽的固相合成 P81,1. 基因工程 2. 细胞工程 3. 酶工程 P82,基因工程合成蛋白质,基因工程药品,（1）.传统的蛋白质药品（如动物激素）：,控制某种物质合成基因,转基因“工程菌”,基因工程药品,基因表达产物,从动物组织中提取，生产量小，价格昂贵。,（3）基因工程生产的药品,发酵罐,（2）基因工程方法生产药品的方法：,杂交瘤细胞,蛋白质结构与功能,第 四 节,一级结构是蛋白质生物学功能的基础,一、蛋白质一级结构与功能的关系,1、一级结构不同，功能不同,2. 一级结构中关健部分相同，其功能相同,人
13、,猪,牛,剩2-10,丧失活性,活性仍100,3.一级结构中“关键”部分变化，其生物活性也改变,例：镰刀形红细胞贫血,4. 一级结构的变化与疾病的关系,这种由遗传物质DNA突变引起的、在分子水平上仅存在微观差异而导致的疾病，称为“分子病”。,二、蛋白质空间结构与功能的关系,1. 蛋白质前体的活化,蛋白质分子特定的空间构象是蛋白质实现其功能或活性所必需,蛋白质空间结构的改变伴随其功能的变化，而一级结构没有变化，称为变构效应。,2. 蛋白质的变构现象,3.蛋白质构象改变与疾病,因蛋白质折叠错误或折叠导致构象异常变化引起的疾病，称为蛋白质构象病。,疯牛病是由朊病毒蛋白( PrP)引起的一组人和动物神
14、经退行性病变。,不同生物与人的Cytc的AA差异数目,生物 AA差异数目 黑猩猩 0 恒河猴 1 兔 9 牛、猪、羊、狗 10 响尾蛇 14 海龟 15 金枪鱼 21 蛾 31 小麦 35 酵母 44,三、蛋白质的一级结构与生物进化,第五节,蛋白质的性质,一、蛋白质分子的大小、形状及分子量测定,1、分子筛层析,P87 表4-9,2、SDS-PAGE,SDS-十二烷基硫酸钠,3.生物质谱（MS）测定蛋白质分子量大小,二、蛋白质的变性,在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象发生改变或破坏，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。,天然状态，有催化活性,非折叠状态，无活性,尿素、 -巯基乙醇,
15、生物活性的丧失 理化性质的改变 如：黏度增加，失去结晶能力，易被蛋白酶水解等。,2、变性蛋白的特征,3、变性作用的因素 加热、紫外线、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等 。,酒精、紫外线消毒； 高温灭； 除去杂蛋白； 避免活性成分变性。,4、变性作用的意义,视频：蛋白质的变性,三.蛋白质的两性电离,* 蛋白质的等电点（pI) 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。P91表4-10 蛋白质在其等电点时溶解度最低。,四、蛋白质的胶体性质,蛋白质分子大小在胶粒范围之内。,* 蛋白质胶体稳定的因素 颗粒表面电荷 水化层,水化膜,水化膜,2. 低温有机溶剂沉淀蛋白质：04低温操作，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积，沉淀后，应立即分离，以防蛋白质会变性，也可用乙醇沉淀。,1. 中性盐沉淀蛋白质：在蛋白质溶液中加入大量的硫酸铵，硫酸钠或氯化钠
