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1、肿瘤标志物及临床应用,肿瘤标志物Tumor Marker是指由肿瘤细胞产生、反映肿瘤存在和生长的一类物质。 在恶性肿瘤发生和增殖过程中，由肿瘤细胞的基因表达而合成分泌的或是由机体对肿瘤反应而异常产生和/或升高的物质，包括蛋白质、激素、酶（同工酶）及癌基因产物等。,一、基本概念,肿瘤标记物的特点 1、存在于肿瘤细胞的胞核、胞质和胞膜上或分泌在体液中； 2、有些不存在于正常成人组织而见于胚胎组织； 3、有些在肿瘤组织中的含量超过正常组织的含量。 肿瘤标志物的存在或含量的变化可以提示肿瘤的性质并有助于了解肿瘤的组织起源和细胞分化，从而可以帮助肿瘤的病理诊断、组织学分类、判断预后及指导临床治疗。,早在
2、1845年，英国的Maclntire首先发现了肿瘤标志物，并于1847年由Bence Jones称之为“白蛋白样物质”（Albumin-like substance）。 1889年，Kahler将其分类为“复合骨髓瘤”的一种分解产物。 1929年，Hirszfeld报道在肿瘤组织中发现了胚胎性特殊物质。 1943年，Gross论证了关于肿瘤组织的抗原性。 1952年，Bjorklund将56种肿瘤组织的提取液混合后注入马体内，产生了抗血清，从而进一步发现了肿瘤组织比正常组织具有更强的抗原性。 1957年，他将这些最初广泛应用的肿瘤标志物定义为组织多肽抗原。,二、肿瘤标志物的发展简史,Ziler
3、（1958年）在胎儿组织中发现了甲胎蛋白（AFP）。 Goldt和Freedman（1965年）从结肠癌的提取液中发现了癌胚抗原（CEA）。 1975年，Kohler和Milstein用细胞融合法成功地制备了单克隆抗体，这就为研究肿瘤标志物提供了更有意义的手段。 80年代以后，用于肿瘤细胞抗原分析的单克隆抗体（Mab）大量涌现，高敏感的免疫组化技术（IH）应运而生。 生物化学、免疫学及分子生物学等方法的建立加速了肿瘤标志物研究的发展。,三、肿瘤标志物检测的意义,1、确定肿瘤的组织发生 2、异位肿瘤和转移性肿瘤的鉴别 3、辅助识别肿瘤的良恶性，癌前病变与癌 4、对肿瘤细胞增生程度的评价 5、辅助
4、肿瘤分期： 在判断肿瘤是原位还是有浸润发生以及有无血管、淋巴管的侵袭是与肿瘤分期密切相关的。 例如用层粘连蛋白（laminin）和型胶原的单克隆抗体可清楚显示基底膜的主要成分。一旦证实癌细胞突破了基底膜，就不是原位癌，而是浸润癌了，其预后意义是不同的。,1、肿瘤免疫组织化学标记 阳性标记色度特征 肿瘤免疫组织化学标记着色程度取决于抗原含量、分布密度和标记方法及其敏感性。 淡黄色，提示为弱抗原； 棕黄色，提示为中等度抗原； 棕黑色，提示为强抗原。,四、检测方法,胞膜型 胞核型 胞质型 微绒毛型 抗原颗粒主要分布于腺癌细胞的微绒毛。 复合型 在常规免疫组化标记中，同一种抗原可以同时表达于胞膜和胞质
5、、胞核和胞质、微绒毛和胞质，但很少发现胞膜和胞核同时表达。,免疫组化结果的判断原则 必须设染色对照 抗原表达必须在特定部位 不在抗原所在部位的阳性表达一概不能视为阳性 阴性结果不能视为抗原不表达 对免疫组化标记结果的意义不能绝对化,假阴性结果的原因主要是 抗体已失活或浓度不当或抗体本身达不到应有的敏感度； 由于组织自溶，抗原扩散而导致抗原消失，特别在长期固定的标本中因抗原漏出而致假阴性，因此多用新鲜固定之标本； 操作步骤不当，如反应时间不够或过久、洗脱不够或温度过高； 组织或细胞中抗原的含量过低，所用方法难以检测到，如用直接法检测为阴性，但改用间接法时则为阳性。,假阳性结果的主要原因是 所用的
6、抗体与其他无关的抗原有交叉反应，特异性差，特别在应用多克隆抗血清时更易出现； 所用的抗体浓度过高或染色过程中切片干燥导致抗体与组织产生非特异性结合； 组织或细胞中有内源性过氧化物酶、碱性磷酸酶及生物素等产生非特异性显色； 组织中含有残存的正常组织，如软组织肿瘤浸润至骨骼肌或神经组织，当用抗myoglobin抗体或抗S-100蛋白抗体时，易误诊为横纹肌肉瘤或来源于神经的肿瘤； 由于肿瘤侵犯正常组织与细胞，导致其胞质内可溶性蛋白质释放于组织间隙中，并为肿瘤细胞非特异性吸收或吞噬。,2、PAP法和APAAP法 过氧化物酶-抗过氧化物酶法（PAP）和碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶法（APAAP）的原理是：应
7、用抗酶抗体与酶结合，形成可溶性的、稳定的酶-抗酶抗体复合物。,3、ABC法 将亲合素（A）与生物素（B）标记的过氧化物酶结合，形成可溶性的亲合素-生物素化酶复合物（avidin-biotin-peroxidase complex, ABC）。当其与生物素标记的抗体（直接法）或抗抗体（间接法）作用时，ABC中亲合素尚未饱和的位点可与抗体分子上标记的生物素结合，从而形成一个多级放大体系，有效提高了酶反应的敏感性。,4、分子生物学方法 PCR PAGE,五、有关肿瘤标志物,角蛋白 来源及分布 角蛋白（keratin）属中间丝细胞骨架蛋白，是存在于上皮细胞内、分子量为40-70kD的一组蛋白质。 主要
8、用途 角蛋白是上皮细胞及其肿瘤的最佳标记物之一，综合肿瘤组织形态学，可用于癌与其他恶性肿瘤如未分化癌与淋巴瘤、上皮性肿瘤与恶性黑色素瘤、胸腺瘤与胸腺淋巴瘤及转移肿瘤等的鉴别。,（一）上皮组织及其标记物,上皮膜抗原 来源及分布 上皮膜抗原（epithelial membrane antigen ,EMA）是上皮细胞分泌的一种人乳中脂肪球膜上提纯的一种糖蛋白，它广泛存在于各种上皮细胞膜系结构，其分布与细胞角蛋白极为相似，但对内脏腺上皮优于细胞角蛋白。上皮膜抗原广泛存在于正常上皮细胞及其肿瘤组织中，也存在于间皮细胞、浆细胞、组织细胞和T细胞淋巴瘤中，尤其是分化较差的癌上皮膜抗原有时可呈强阳性表达。
9、主要用途 EMA可作为上皮源性肿瘤的常用标记物。EMA阳性表达的肿瘤有鳞状细胞癌、胃肠道腺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、间皮瘤、滑膜肉瘤、甲状腺乳头状腺癌、上皮样肉瘤等。,甲胎蛋白（alpha-fetoprotein, AFP） 来源 甲胎蛋白是由胚胎卵黄囊细胞、胚胎肝细胞和胎儿肠道细胞所合成的一种糖蛋白，分子量为69kD。在妊娠5个月时达高峰，出生时下降。胎儿出生后1年，血清AFP应降至正常成人水平。正常成人血清中的含量极低，为5.8g/L以下，男性略高于女性。恶性肿瘤的成人，妊娠第2-3个月或患有肝硬化、肝坏死患者血清中AFP水平可升高。 AFP是原发性肝癌的最灵敏、最特异的肿瘤标志，血清
10、AFP测定结果大于500g/L以上，或含量有不断增高者，更应高度警惕。,主要用途 AFP主要用于原发性肝细胞癌和性腺或性腺外某些生殖细胞肿瘤（如内胚窦瘤）的诊断和鉴别诊断。值得注意的是AFP在肝癌组织中的阳性表达只占60%左右，部分病例则为阴性，而一些非肿瘤性肝病变（如肝硬化和肝炎）肝细胞以及肝转移性肿瘤的癌旁肝细胞亦有AFP表达。后者AFP的来源有三种可能性，一是癌旁肝细胞自己合成；二是癌旁肝细胞从癌灶内吸收AFP；三是上述两种情况都有。,应用中的注意事项 AFP阴性不能排除肝细胞癌的诊断，应进一步作丙氨酸转氨酶（alannine aminotransferase, ATT）免疫组化或结合血
11、清学检查结果加以判断； 发生在骶尾部、腹膜后、纵隔或松果体的一些生殖细胞肿瘤，在常规HE染色中常常诊断为未分化癌，因此有必要作AFP或人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonatotropin, HCG）免疫组化染色，以排除其他类型的肿瘤； 一些非肝性肿瘤如肺癌、乳腺癌和胃肠癌，尤其是胃肝样腺癌，AFP可呈阳性反应。,AFU -L岩藻糖苷酶（-L-fucosidase，AFU）：是一种溶酶体酸性水解酶，是原发性肝癌的一种新的诊断标志物，广泛分布于人体组织细胞、血液和体液中，参与体内糖蛋白、糖脂和寡糖的代谢。原发性肝癌患者血清AFU活力显著高于其它各类疾患（包括良、恶性肿瘤）。
12、,癌胚蛋白（carcinoembryonic antigen, CEA） 来源及分布 癌胚蛋白是从结肠癌中分离出来的一组酸性糖蛋白，由胆管上皮细胞合成。该蛋白在胚胎期含量较高，而成人则含量较低，小于2.5g/L 。CEA在正常组织中的表达包括有结肠、胃、小肠和胆囊的上皮细胞。免疫组化染色阳性表达部位均位于表面上皮细胞的刷状缘，呈线状分布。,内外分泌腺的腺泡细胞和导管上皮细胞及其分泌物均见有CEA表达，而皮脂腺、皮肤鳞状上皮细胞和宫颈、食管及鼻咽粘膜的鳞状上皮细胞不含CEA。CEA偶见于良性上皮性肿瘤及癌前病变组织中，而在许多癌组织中则有大量表达，如胃肠道及胰腺癌、肺癌及甲状腺髓样癌。,主要用途
13、 CEA与EMA一样均可作为上皮性肿瘤的重要标记，尤其是它不受肿瘤分化程度的影响，即使是低分化腺癌亦可呈阳性反应，这一点与CK不同，因此在转移癌的鉴别诊断上可与EMA、CK联合使用，以提高诊断正确率。 由于CEA是一种分泌性抗原，该抗原可由肿瘤细胞分泌于血液中，可以在血清中测得其抗原水平，故临床可用于：胃肠道癌的粗筛普查；术前术后的CEA水平动态观察；及时发现癌肿的复发与转移。,应用时的注意事项： CEA阳性不能作为确认肿瘤的组织来源标记； CEA不能用作良、恶性上皮性肿瘤的鉴别诊断； 不论是单克隆还是多克隆抗CEA抗体，在某些肿瘤组织中可表现有非特异性染色，应注意鉴别。,当CEA高于20g/
14、L时，则意味着可能有消化道肿瘤。,肿瘤抗原（carcinomic antigen，CA，也可以写作cancer antigen）是肿瘤细胞膜的结构成分，各不相同，为糖蛋白或糖脂，也叫糖类抗原（carbohydrate antigen，CA）。这类抗原是用单克隆抗体技术从肿瘤细胞系（株）中鉴定出来的，所以在特定肿瘤的诊断方面具有较高的准确性。,CA242 CA242是一种唾液酸化的黏蛋白类型的糖抗原，其单克隆抗体是Lindholm 等于1985年通过杂交瘤技术用人结肠癌细胞株COLO205免疫鼠而得，免疫组化研究发现CA242在恶性组织如胰腺癌和结肠癌中有明显表达，而在其他器官的腺癌中亦有轻度表
15、达。,CEA与糖类抗原242（CA242）联合应用目前被认为是对结肠癌的最佳标志搭配。,CA15-3：CA15-3是1984年Hilkens等从人乳脂肪球膜上糖蛋白MAM-6制成的小鼠单克隆抗体（115-DB）；1984年Kufu等自肝转移乳腺癌细胞膜制成单克隆抗体（DF-3），故命名CA15-3。 由分泌性上皮细胞（如乳腺、肺、胃肠道、子宫的）分泌，正常人排泄物中也可检出。此抗原虽然没有器官和肿瘤特异性，在乳腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌和胃肠道癌中指标均有升高（大于30U/ml）。 但可作为监测乳腺癌患者术后复发的最佳指标。在其它乳腺疾病和部分孕妇（约8%）中CA15-3也有升高。,CA19
16、-9：CA19-9是1979年Koprowski等用结肠癌细胞免疫小鼠，并于骨髓瘤杂交所得116NS19-9单克隆抗体。 CA19-9是一种糖脂，正常人血清中小于37U/ml，85-95的胰腺癌患者该项指标较高。手术切除肿瘤后，CA19-9浓度会下降，如再上升，则可表示复发。结直肠癌、胆囊癌、胆管癌、肝癌和胃癌的阳性率也会很高，若同时检测CEA和AFP可进一步提高阳性检测率。,CA125：CA125是1983年Bast等从上皮性卵巢癌监测出可被单克隆抗体OC125结合的一种糖蛋白。 CA125是上皮性卵巢癌和子宫内膜癌的标志物，正常人血清中小于35U/ml。胰腺癌、肝癌、乳腺癌和子宫内膜炎，急性胰腺炎、腹膜炎、肝炎、肝硬化腹水也可使CA-125升高，CA-125升高还与肿瘤复发有关。,CA50：CA50是1983年Lindholm等从抗人结肠癌、直肠癌Colo-205细胞株的一系列单克隆抗体中筛选出一株对结肠癌、直肠癌有强烈反应，但不与骨髓溜细胞及血淋巴细胞反映的单克隆抗体所能识别的抗原。CA50存在于细胞
