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1、重组DNA技术是在分子水平对基因进行体外操作，因而也称为分子克隆(molecular cloning)或基因克隆。 所谓克隆(clone)：是指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。,分子克隆：是在体外对DNA分子按照既定的目的和方案进行人工重组，将重组分子导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得DNA分子大量复制，并使受体细胞获得新得遗传特征的过程,基因工程：利用分子克隆技术来操作目的基因，并改变生物的遗传性状的过程就称为基因工程。,基因工程最基本的必备的材料： 工具酶 载体 目的基因 原核或真核宿主细胞,分子克隆的基本过程: 分：得到目的基因 切：将目的基因和载体
2、用适当的限制性内切酶切割 接：将目的基因和载体连接，形成重组子 转：将重组子转到适当的宿主细胞中 筛：筛选出含正确重组子的宿主细胞，扩增,第一节 基因工程中常用工具酶,工具酶分类 使核酸降解的核酸酶类：核酸内切酶、核酸外切酶 催化核酸合成的酶类：DNA聚合酶，RNA聚合酶，连接酶，逆转录酶 核酸修饰酶类：甲基化酶，激酶，基团转移酶， 磷酸酶等,一、 限制性核酸内切酶,概念的提出及背景： 30年代初，微生物学家发现，微生物的噬菌体不能交叉感染（“细菌免疫”）。 限制现象（限制性内切酶） 修饰现象（甲基化酶）,1962年W. Arber提出；菌体中含有2种以上功能不同的酶： 核酸内切酶（限制） D
3、NA甲基化酶 （修饰）,限制性核酸内切酶(restriction endonuclease，RE) 是由细菌自己产生的一种能识别双链DNA中的特定序列，并以内切方式水解核酸中磷酸二酯键的核酸内切酶。,1限制性核酸内切酶的分类：,I型RE： 由三种不同的亚基组成。需Mg+，S-腺苷甲硫氨酸（SAM），ATP为辅助因子；识别位点复杂，特异性差。通常在识别位点的4007000bp范围内切割DNA。现已报道19种。,型RE；由两种亚基组成。需Mg+，ATP为辅助因子；切割位点靠近识别序列但较难预测。一般在2527bp范围内切割。现已报道4种。 I、型RE酶同时具有限制(剪切)与修饰(甲基化)两种功能并
4、依赖于ATP，切割DNA链的位置远离识别序列，因此I型和型酶在DNA重组技术中都不常用。,型RE实际应用价值最大，这是因为： 型酶只具有限制性活性，无甲基化修饰活性； 对DNA的切割要求严格的序列作为靶位点，切割精确； 此类酶作用时只需Mg2+参与，无需ATP。 因此型限制性核酸内切酶是基因工程中剪切DNA分子的常用工具酶，被誉为“分子生物学家的手术刀”。,2限制性内切酶的命名 目前已广泛采用Smith和Nathams于1973年提出的命名系统： 限制性内切酶第1个大写字母：来自细菌的属名(genus)， 第2、3个小写字母：来自种名(species)， 第四个字母代表菌株(strain),3
5、型限制性内切酶的作用特点： 被分子生物学家广泛研究应用，现已发现有200多种识别序列的RE MW=60KD的单链多肽 最适pH：68 NaCl有抑制作用，Mg2+ 激活，巯基有保护作用 热不稳定。,作用特点： 有严格的识别、切割的DNA序列，并以内切的方式水解双链DNA中的磷酸二酯键。 识别序列一般为46个碱基对。 切割靶序列的大小决定了切割DNA链后产生的DNA片段的长短 切割后产生平头或粘性末端。 只需Mg2+，不需ATP。,4. 型酶切割dsDNA可产生两种不同的切口 1. 平头末端(blunt end) 即在识别序列的对称轴上进行切割； 2. 粘性末端(cohesive end) 即在
6、识别序列的两个对称点切开DNA双链，产生末端带有单链尾巴的切口。根据突出端不同分为：5粘性末端和3粘性末端。,型酶切割dsDNA产生的两种不同的切口,5. 三类特殊性质的型限制性内切酶： 同裂酶(isoschizomer)：又称源同异工酶，即识别位点相同，但切割位点可以相同，也可以不同，例如Sam I(CCCGGG)和Xma I(CCCGGG),Sau3A I BamH I GATC GGATCC CTAG CCTAGG SauI Xho I GTCGAC CTCGAG CAGCTG GAGCTC,同尾酶(isocaudarmer)：不同来源的酶其识别和切割序列有一定的相关性，作用后能产生相同
7、的粘性末端。,可变酶：此种酶所识别DNA序列中的一个或几个碱基是可变的，并且识别序列往往超过6个碱基对，例如Bstp I识别序列为：GGTNACC，其中N为一可变碱基。,6. RE识别序列呈反向对称，分为四种类型,回文结构：（Palindrome） 如：EcoRI：5， G AATTC3， 3， CTTAA G5， 间断回文结构（interrupted Palindrome） 如：BgI：5，GCCNNNN NGGC3， 3，CGGN NNNNCCG5 ,简并序列（degenerate sequence）又称“松弛”特异识别，即识别位点中某些核苷酸可以被其他核苷酸替换。 如：5 3 3 5 非
8、回文结构： 如：5 3 3 5 ,7限制性内切酶的应用,限制性内切酶除作为基因工程中剪切DNA的工具外，还广泛应用于分子生物学研究的各个领域内。,绘制物理图谱及基因同源性比较 DNA测序及基因组分析 基因突变与遗传性疾病的诊断等 改造及重组质粒 DNA克隆及亚克隆的建立,8. RE使用时的注意事项,要求较纯的底物DNA Mg2+和Tris-HCl缓冲体系，pH7.2-7.6 反应体系中不能含有酚、氯仿、乙醚、SDS以及大于10mmolL的EDTA 适合的离子强度 二硫苏糖醇或-巯基乙醇 低温或冰浴,二、DNA聚合酶 DNA polymerase,分子克隆常用的DNA聚合酶： 依赖DNA的大肠杆
9、菌DNA聚合酶I Klenow大片段 T4噬菌体DNA聚合酶 Teq DNA聚合酶 T7噬菌体DNA聚合酶 经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶（测序酶） 耐热DNA聚合酶 依赖RNA 的DNA聚合酶（逆转录酶）,1DNA聚合酶I：,DNA聚合酶I是Kornberg从大肠杆菌中发现的第一个DNA聚合酶。此酶是一个多功能酶，包括3种酶活性： 5-3聚合酶活性：催化单核苷酸聚合到DNA的3-OH末端，使DNA链从5-3延伸； 5-3外切酶活性：即从游离的5末端降解双链DNA或单链DNA成为单核苷酸 3-5外切酶活性。 另外该酶还具有RNA酶H活性（降解DNA-RNA杂合体中的RNA）。,DNA聚合酶I作
10、用条件：, 全部4种dNTP(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)、Mg2+ DNA作为模板，单链DNA或有缺口的双链DNA均可； 需要具有游离3-OH的引物或缺口的3末端,DNA聚合酶I的应用：, 催化DNA切刻平移(nick translation)反应，制备高比活性DNA探针 第二条cDNA链的合成； 对DNA 3凸出末端进行末端标记； DNA序列分析,2Klenow片段,C末端大片段Klenow片段（70KD） 含5-3聚合酶活性和3-5外切酶活性 （保证了DNA复制的精确性） 枯草杆菌 蛋白水解酶 DNA聚合酶I N末端小片段 含5-3外切酶活性,Klenow片段功能：,双脱氧法
11、序列分析 随机引物标记核酸探针 cDNA第二链合成 对5凸出粘端补平或对双链DNA 3端标记 PCR技术：PCR技术是根据Klenow酶的5-3聚合活性而设计诞生的,3T4噬菌体DNA聚合酶,从T4噬菌体感染E.coli中获得。 MW=114KD 单链多肽。 活性与Klenow片段相似：5-3聚合活性；3-5外切活性。 特点： 1.外切活性=Klenow片段外切200倍 2.外切活性的强度：单链底物大于双链底物,应用：,补平或标记5凸出粘端。 对DNA 3凸出粘端进行末端标记。 用3-5外切活性切除3凸出粘端，甚至形成5凸出粘端，再用高浓度dNTP标记掺入，利用5-3聚合活性获得标记物。 通过
12、取代反应，标记核酸探针。,5 3 3 5 T4 DNA pol 35外切活性 5 3 3 5 T4 DNA pol 32PdNTP 5 3 3 5 E CoRI，BamHI RE消化 5 35 3 3 53 5 凝胶电泳提取纯化特异探针,T4DNA聚合酶的应用（标记探针）,4. Taq DNA聚合酶,Taq DNA聚合酶是一种依赖DNA的单亚基耐热DNA聚合酶，分子量约为65kD。该酶最初由极端嗜热水生菌Thermus aquaticus中提取并纯化，目前已能通过基因工程方式大量生产。,Taq DNA聚合酶的应用,Taq DNA聚合酶主要用于PCR中。最适温度在7075，随着温度的降低，酶活性
13、明显下降。同时此酶缺乏3-5外切酶活性，因而无校正功能。,Taq DNA聚合酶的应用条件,需Mg2+（1mmol/L）。 低浓度Mn2+（2mmol/L）有低活性。 Ca2+使其完全失活。 一价阳离子高至0.1mol/L对其活性无影响。 最适浓度：NaCl=40mmoL/L KCl =60mmol/L 最适pH：7.8 Tris-HCl buff,三、DNA连接酶：,催化双链DNA中相邻碱基的5磷酸和3羟基间磷酸二酯键形成的酶，称为DNA连接酶(DNA ligase)。 DNA连接酶主要有两种： T4噬菌体DNA连接酶 大肠杆菌DNA连接酶,1T4噬菌体DNA连接酶,T4 DNA连接酶最早是从
14、T4噬菌体感染的大肠杆菌中发现并分离的，分子量68kDa。,主要功能及用途： 连接双链DNA中一条链上的切口 连接互补粘性末端的DNA片段（连接反应通常在1215下进行） DNA分子间的平头末端 （平端的连接通常在室温下进行）,2大肠杆菌DNA连接酶,特点： 连接双链DNA中一条链上的切口 间存在的互补粘性末端的DNA片段需NAD+ 连接平头末端DNA分子需聚乙二醇或Ficoll 、情况下可代替T4DNA连接酶，它产生的背景低，准确性高。,大肠杆菌DNA连接酶功能,可修复dsDNA中的单链切口，并可催化互补黏性末端的连接，主要用于cDNA第二链的合成。 能促进平端连接，但效率仍很低； 在非平端
15、连接时可代替T4DNA连接酶，它产生的背景低，准确性高。,四、反转录酶：,能以RNA为模板合成DNA的DNA聚合酶称为反转录酶(reverse transcriptase，RT)，合成的DNA产物称为互补DNA (complementary DNA，cDNA)。 常用的逆转录酶有禽类成骨细胞性白血病病毒(AMV)逆转录酶和Moloney小鼠白血病病毒(Mo-MLV)逆转录酶,反转录酶的作用特点：,以单链RNA或单链DNA为模板合成DNA，可用于cDNA第一链和第二链的合成 有5-3和3-5RNA外切酶活性，3-5RNA外切酶活性可用于降解RNA-DNA杂交分子中RNA 缺乏3-5DNA核酸外切酶活性,反转录酶的应用：,cDNA的合成 补平和标记DNA的3 末端 代替Klenow片段 杂交探针的制备,五、 末端转移酶,末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deosynucleotidyl
