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1、鼻咽癌肿瘤标志物Rta-IgG在临床检验中的应用谢小兵 解决六个问题1. Rta是鼻咽癌特异性肿瘤标志物的科学依据？2. 检测鼻咽癌灵敏度和特异性的临床证据？3. Rta与其他EBV标志物联检的好处？4. 为什么要做鼻咽癌筛查？5. Rta抗体阳性怎么办？6. Rta定量检测的临床意义？ 一、Rta是鼻咽癌特异性肿瘤标志物基础研究的几件大事 20世纪70年代曾毅博士与法国巴斯德病毒研究院合作，首创使用细胞免疫酶法检测血清EBV衣壳抗原（CA，capsid antigen）抗体IgA，证明病毒活跃复制，间接推断鼻咽癌。 1984年Baer在Nature杂志发表了EBV基因组序列，为阐明EBV和鼻
2、咽癌发生的关系奠定了基础。Zalani等（1996）首先发现EBV immediate early gene（立早基因）BRLF1仅在上皮细胞中被激活表达编码蛋白Rta；其后，Yoshizaki等（吉崎, 1999）证明了编码蛋白Rta是诱导鼻咽癌上皮细胞分裂癌变的元凶。为研究鼻咽癌标志物奠定了基础。基础研究的几件大事 中国旅美科学家胡怀忠博士及其团队首先证明检测血液中Rta抗体能特异性地检测出鼻咽癌（2000, 2001）。 同昕“站在科学巨人的肩膀上”，将Rta的研究成果在中国实现产业化，研制出独家专利产品Rta-IgG抗体ELISA法检测试剂盒，2009年获得CFDA产品注册证，成为首个
3、被药监局批准在说明书上写明可用于 “鼻咽癌辅助诊断及相应临床管理”的产品。EB病毒感染 1964年EpsteinAchongBarr在The Lancet报告发现于非洲的一种新的非常小的疱疹病毒，命名为Epstein-Barr Virus（EBV）。 EBV的结构特征：极具粘附力的囊膜，极易合成的衣壳，双链DNA基因组 唾液传染，全球95以上的成人携带此病毒，主要侵犯并潜伏在B淋巴细胞内。一旦被激活，EBV基因组呈现两种感染转归(Ganem, 2007; Rickinson and Kieff, 2007) ： Productive Infection（病毒裂解复制）: DNA extrach
4、romosomal genomes replicate to produce mature progeny viruses, leading to the formation of benign warts. Non-Productive Infection（致癌因子表达）: DNA integrates into the host genome, it chronically expresses its oncogenic early proteins, fails to replicate, and elicits cancers (Moody and Laimins, 2010). EB
5、病毒基因谱：Rta 蛋白是进入裂解期的启动蛋白Feng & Hu,J General Virol (2000) 81:24172423HuAmon & Farrell,Rev Med Virol (2005) 15:149-156Guito & Lukac,Frontiers in Microbio (2012) 3:1-21LatencyLytic Cycle Immediate EarlyEarly GenesLate GenesBRLF1EA Latent GenesEBNA1, -2, -3A, -3CLMP1, 2A, 2BEBER1, -2BARF0CA Rta “VCA is a
6、 true late gene” by Sun & Miller.Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. (1998)95:1086610871Rta has the potential to activate EBV gene expression broadly during infectionEBV的立即早期裂解基因BRLF1表达编码蛋白RtaBRLF1Hu, et al.J Gen Virol 2000, 81:2417-23Rta BRLF1基因：1818bp，由Rp启动子启动，转录成3.3kb的mRNA直接翻译出Rta蛋白 Rta蛋白由605个氨基酸组成，分子量大（6
7、6,594 Da）,化学成分复杂，抗原表位表露，具有很强的抗原性，引发人体产生相应的免疫球蛋白抗体。EB病毒感染:B淋巴细胞宿主B淋巴细胞鼻咽粘膜上皮 病毒裂解复制上皮感染BRLF1基因突变Rta编码蛋白诱导癌变病毒病鼻咽癌 Nature Review，2004致癌因子表达Rta改变细胞周期，促进细胞癌变的作用S期诱导协助病毒复制增加ATF2的磷酸化水平可能导致细胞膜成分改变病毒复制关键基因增多 增加P53与P21蛋白表达水平1 2 3 4增加p38和JNK的活性启动FAS基因表达与Rb结合使E2F1增多EBV由隐性状态向裂解状态转换形成癌变RtaEpstein-Barr virus imme
8、diate-early protein Rta activates 14-3-3 expression to regulate cell cycle progression.EBV Rta Enhances Micronucleus Formation, DNA Strand Break and Accelerates M Phase Progression in Human Epithelial Cells鼻咽部细胞分裂发生癌变时，EB病毒BRLF1基因特异性地表达Rta蛋白，诱发机体产生Rta蛋白抗体，成为检测鼻咽癌的特异性血清学指标(Klein et al, 2007).胡怀忠:1994
9、荷兰Utrecht University获博士学位。后在美国NIH做博士后训练。EB病毒Rta蛋白与鼻咽癌的检测: 科学家胡怀忠的研究1997年被新加坡国立大学聘为教授，专门从事鼻咽癌分子生物学的研究工作。2006年受聘于美国COVINCE公司任R&D高级研究员。2005年8月至今，领导“EB病毒Rta蛋白抗体IgG检测试剂盒”的研发工作。 证明BRLF1基因在NPC活检组织中特异性表达，产生具抗原性的Rta蛋白验证NPC患者血液中存在抗BRLF1产物Rta蛋白的抗体确认Rta蛋白最强抗原簇部位：R185I+R150I两个多肽片段BRLF1基因在NPC肿瘤中特异性表达：标志物的明确根据 用RT
10、PCR的方法对主要的EBV裂解基因在鼻咽部活检组织（包括肿瘤组织和正常组织）当中的表达情况进行研究， 发现在NPC样本和对照样本中BZLF1、BALF2和BCLF1均能检出，而立早基因BRLF1只在NPC肿瘤样本中检测到，在正常组织中未能检出。 这一结果说明BRLF1基因编码蛋白Rta是在NPC特异性肿瘤标志物。 (P：阳性对照取自鼻咽癌B95-8细胞系；N：阴性对照，在PCR反应中不加cDNA)nasopharynx biopsies二、检测鼻咽癌灵敏度和特异性的临床证据 曾毅院士领导的研究组使用Rta蛋白为抗原，用间接ELISA方法分别检测NPC病人和正常对照组血样中的IgG和IgA抗体，
11、进行NPC检测的临床研究，得出结论：Rta-IgG抗体检测NPC的灵敏度达到84.7%，特异性为88.1%，比IgA抗体更为灵敏，可以作为NPC血清学诊断的重要标志物之一。曾毅院士团队的研究 NPC (59) 健康对照(59)Rta-IgG阳性 50 (84.7%) 7 (88.1%)Rta-IgA阳性 26 (44.1%) 0 (100%)任军; 曾毅;以Rtac2/3为抗原用于鼻咽癌病人检测的初步研究J;中华微生物学和免疫学杂志;2006年11期中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 Rta-IgG檢測鼻咽癌：國內臨床檢測驗證試驗單位 鼻咽癌數 正常對照 檢測結果靈敏度 特異性廣東中山醫大臨
12、檢中心2010年8月 191 337 91.9 95.6福建中醫藥大體檢中心2011年10月 20 1000 85.0 91.9廣州中山大學免疫學系2010年5月 300 500 92.7 94.5四川華西醫大腫瘤學系2009年11月 274 353 90.5 91.8廣西醫大腫瘤研究中心2009年12月 572 500 86.7 93.9廣東四會市腫瘤研究所2009年5月 510 300 89.2 98.4合計 1867 2990 89.3% 94.4%报CFDA注册审批：Rta/IgG临床实验数据单位 内容 鼻咽癌病人组数目 正常对照组数目 备注中山大学附属肿瘤医院 RtaIgG阳性 82
13、 5RtaIgG阴性 18 95总数 100 100灵敏度 82%特异性 95%广西医科大学附属肿瘤医院 RtaIgG阳性 225 29RtaIgG阴性 49 324总数 274 353灵敏度 82.12%特异性 91.78%福建省肿瘤医院 RtaIgG阳性 77 10RtaIgG阴性 23 90总数 100 100灵敏度 77%特异性 90% 于2009年5月由CFDA评审专家组建议，经CFDA批准，成为首个在说明书上标注“用于鼻咽癌的辅助诊断和相应的临床管理”的试剂盒产品。Rta-IgG阳性率的一个回顾性调查 中山大学肿瘤防治中心黄培钰等报导（中华医学杂志，2013），131例经病理确诊的
14、不同临床分期的鼻咽癌患者血清进行Rta-IgG抗体进行检测，证明Rta-IgG阳性率随着临床分期的增高而增高，特别在III、IV期间有显著性差异，能很好反应肿瘤消长，有助于评估鼻咽癌患者病程和有望成为分期系统的分子指标。临床分期 例数 Rta-IgG阳性（例） 阳性率I 3 1 33%II 17 13 76%III 66 47 71%IV 45 41 91%创新产品Rta/IgG引发一系列临床研究 Rta/IgG试剂盒的问世，引起了新一轮用EB病毒抗原检测鼻咽癌的临床应用研究热潮，除了前述的很多Rta/IgG效果验证的成果发布以外，研究课题在不断地深入扩展，包括Rta/IgG在自然人群中筛查鼻
15、咽癌的前瞻性研究、监测治疗效果和预后判断、与其他靶标联合检测的研究、以及与其他不同的检测方法比较研究，等等。Rta/IgG检测鼻咽癌受到的广泛关注在第八届全国鼻咽癌学术会议上大会演讲“Rta：鼻咽癌新靶标” 2012年海峡两岸鼻咽癌高峰会演讲“Rta：一个新的鼻咽癌肿瘤标记物参加2011年卫生部早诊早治项目鼻咽癌培训班，介绍Rta/IgG检测各种鼻咽癌会议期间，介绍Rta/IgG检测的展台受到同行关注技术人员应用户 要 求 做Rta/IgG检测技术培训 2013年香港癌症诊断与治疗研讨会，UCLA翟教授大会发言： Rta - a blockbuster biomarker of the nas
16、opharyngeal carcinoma 2013年11月澳门卫生局临检中心主办癌症诊断新趋势讲座，UCLA翟教授主讲：Rta - 鼻咽癌最新一代標誌物2012年1月Rta抗体检测列入卫生部临床检验目录中国家卫生计生委公布2013版医疗机构临床检验项目目录再次收录Rta为独立临床检验新项目（#1122）Rta发明专利成果应用于临床，在国际上首先研制出检测鼻咽癌的产品：Rta/IgG抗体检测试剂盒创新点： 早 - Rta 蛋白是细胞刚刚开始分裂癌变时表达出的分子靶标，因此检测血液中Rta抗体IgG，可以在癌肿出现之前早期作出诊断。 准 -Rta 仅在鼻咽癌细胞中高量表达，因此对诊断鼻咽癌具有特异性。 适于
