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1、第三章 细胞生物学研究方法,STUDY METHODS OF CELL BIOLOGY,本章内容提要,细胞生物学研究方法多种多样,总的说来,可分为四个大类:显微技术细胞组分分析与原位检测技术细胞培养与细胞工程分子生物学技术,第一节 细胞形态结构的观察方法,显微镜是观察细胞的主要工具。根据光源不同可分为:,光学显微镜和电子显微镜两大类。,前者以可见光（紫外线显微镜以紫外光）为光源，后者则以电子束为光源,显微镜的发明打开了微观世界的大门,光学显微镜,透射电子显微镜,扫描电子显微镜,、光学显微技术,普通复式光学显微镜荧光显微镜激光共聚焦扫描显微镜暗视野显微镜相差和微分干涉显微镜倒置显微镜,1.显微镜
2、的发明,300多年前 Leeuwenhoek 世界上最早的显微镜,Robert Hooke 软木蜂窝状的小格子“细胞”,（一）普通光学显微镜 Light microscopy,Large Student Microscope made byCharles Chevalier 1840,1812年，苏格兰人D. Brewster 发明油浸物镜，改进了体视显微镜。,现代显微镜,2.光学显微镜构成： 照明系统: 光学放大系统: 机械装置:镜座.镜柱等,目镜与物镜(玻璃透镜),光学显微镜,光源、折光镜、聚光镜,3. 成像原理：,经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。,4. 分辨力： D=0.61/
3、NA其中为入射光线波长；NAsin/2，为镜口率 , n=介质折射率；=镜口角（样品对物镜镜口的张角） 。,指分辨物体最小间隔的能力. 是显微镜的最重要参数.,如何提高显微镜的分辨能力？,显微镜的物像是否清楚主要决定了哪些因素？,增加分辨率的二个必备条件: 增大镜口率-有一定限度 缩短波长-为可靠办法普通光镜的最大分辨率为0.2m, 大于0.2m的结构为显微结构, 而小于0.2m的称为亚显微结构.,几种介质的折射率,为什么使用油镜能提高分辨率?,不同光线的波长,光学显微镜的几个光学特点：制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.651.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。sin /2的最大值必然小
4、于1；介质为空气，镜口率一般为0.050.95；其中低倍镜0.28，高倍镜0.65，油镜1.25，油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。普通光线的波长为400700nm，分辨力数值不会小于0.2m，人眼的分辨力为0.2mm, 因此光学显微镜的最大设计倍数为1000X。,.普通光镜样品的制作:,取材固定脱水包埋切片脱蜡复水染色脱水透明封片观察,固定剂(甲醛)固定：杀死细胞，稳定细胞的化学成份；包埋剂(石蜡)包埋;切片(5m )；染色:如苏木精对负电荷分子有亲和性，能显示出细胞内核酸的分布；酸性染料如伊红可使细胞质染色；苏丹染料的乙醇饱和溶液能使脂肪着色。,（二）荧光显微镜 Fluoresce
5、nce microscope,特点：光源为紫外线，波长较短，分辨力高于普通显微镜(0.1m )；有两个特殊的滤光片；可观察活细胞.,紫外线发生装置(如弧光灯、水银灯等 ),什么是荧光 ?,物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。,荧光显微镜的光通路,荧光显微镜的特殊用途:用于观察能激发出荧光的结构免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断细胞与组织中物质的吸收与运输化学物质的分布与定位等荧光现象有两种:自发荧光（叶绿素）诱发荧光（加荧光素）,微管呈绿色、微丝红色、核蓝色,Fluorescence image of epitheli
6、al cell, DNA in blue and Microtubules in green,（三）激光共聚焦扫描显微镜 Laser confocal scanning microscope, LCSM,用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。一束光线通过聚焦成点，在样品表面扫描后成象。它是一个扫描光学显微镜，因为在一个时间试样上只有一个点被照亮。随着试样被扫描，像素的积累便构成了图像。因为物镜的焦平面很薄（只有0.5皮米）所以能够获得试样的真正光学断面。所有在焦平面以上或以下的图像数据都到不了探测器。随着焦平面的上升或者下降（Z轴），可以得到试样的分层图像并存储起来，这些分层图像就由计算机重
7、构成三维图像。分辨力是普通光学显微镜的3倍。用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像, 研究亚细胞结构与组分。共聚焦?,物镜与聚光镜同时聚焦到同一个小点。,laser confocal scanning microscope, LCSM,LCSM Image of a Xenopus Melanophore microtubule cytoskeleton (green) and the nucleus (blue),（四）暗视野显微镜 dark field microscope,聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，
8、物体的边缘是亮的。可观察 4200nm的微粒子，分辨率比普通显微镜高50倍。,用以观察未经染色的活体或胶体粒子,暗视野显微镜光路,把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，明者更明，暗者更暗，立体感增强。从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜的特殊之处:物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4.光源聚光器中增加一环形光阑。,（五）相差显微镜phase contrast microscope,由PZernike 于1932年发明，并因此获1953 年诺贝尔物理奖。,原理,用途：观察未经染色的标本和活细胞。,（六）微分干
9、涉显微镜 Differential interference contrast microscope （DIC）,1952年，Nomarski发明，利用两组平面偏振光的干涉，光线经棱镜折射后分成两束，在不同时间经过样品后两束光再会合，从而样品中厚度上的微小差异就转化成明暗区别，加强影像的明暗效果，能显示结构的三维立体投影。观察培养的活细胞。,DIC显微镜下的硅藻,（七）倒置显微镜 inverse microscope,物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，通常具有相差物镜，有的还具有荧光装置。,倒置显微镜,正置显微镜,（八）当代显微镜的发展趋势,采用组合
10、方式，集普通光镜加相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体。自动化与电子化。,(九)荧光共振能量转移技术,荧光能量共振转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)是较早发展起来的一门技术，随着绿色荧光蛋白应用技术的发展，,供体荧光素 受体荧光素,什么是荧光 ?,物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。,任何荧光物质都具有两种特征光谱：激发光谱与发射光谱,39,其中S0、S1和S2分别表示分子的基态、第一和第二电子激发的单重态,T1和T2则分别表示分子的第一和第二电子激
11、发的三重态。,V=0、1、2、3、表示基态和激发态的振动能级。,分子内的光物理过程,保持固有的荧光特性荧光波长激发波长荧光强度极小于激发光的强度有不同程度的衰减荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率,荧光的性质,荧光能量共振转移的原理,I.荧光能量共振转移: 受激态荧光素将其能量向另一个荧光素传递，使后者被激发，这一过程称荧光能量共振转移。能量的提供者叫供体荧光素，能量的接受者叫受体荧光素。,1.供体与受体间的距离 10nm或=1-7nm2.供体的发射光谱与受体的吸收光谱有实质性的重叠,II.荧光能量共振转移的条件,488nm 520nm 650nm,供体荧光素 (Cy2) 受体荧光素
12、 (Cy3),供体荧光素 (Cy2) 受体荧光素 (Cy3),荧光能量共振转移的结果：使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多（荧光猝灭），而受体发射的荧光却大大增强（敏化荧光）。,荧光能量共振转移技术的应用,FRET已经成为检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具，在生物大分子相互作用分析、细胞生理研究、免疫分析等方面有着广泛的应用。,(十)荧光漂白恢复技术,fluorescence photobleaching recovery,FPR 荧光漂白后的恢复技术是将待测细胞用荧光物质标记，借助高强度脉冲式激光照射细胞的某一区域，可以造成该区域荧光分子的光淬灭；通过低强度激光扫描
13、成像，可以探测到该区域周围的非淬灭荧光分子向受照射区域扩散的速率。由于光淬灭过程是不可逆的，荧光恢复过程可明显的反映荧光标记物质及其结合物的运动。,光脱色荧光恢复技术检测膜流动性,二、电子显微技术,（一）透射电子显微镜transmission electron microscope, TEM,通过电子束穿透样品成像,1932 年，德国Ruska 发明了以电子束为光源的透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）。目前TEM 的分辨力可达0.2nm。,透射电子显微镜,(伪彩色),以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，小于0.1nm.由电子照明
14、系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍。用于观察超微结构（ultrastructure），即小于0.2m、光学显微镜下无法看清的结构，又称亚显微结构（submicroscopic structures）。,1. 原理,电子显微镜与光学显微镜的基本区别,分辨本领 光源 透镜 真空 成像原理光学 200nm 可见光 玻璃 不要求 样品吸收光形成明暗显微镜 (400nm- 700nm ) 反差和颜色变化 100nm 紫外光 玻璃 不要求 (约200nm) 电子 0.1nm 电子束 电磁 要求 样品对电子的散射显微镜 ( 0.010.9nm ) 和透射形成明暗反差,光镜与电子显微镜(透射电镜)的结构,2、制样技术,1）超薄切片电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须制成厚度仅50nm的超薄切片，用超薄切片机（ultramicrotome）制作。通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。,电镜制样要求:样品很薄;样品的精细结构保持完好,莱卡超薄切片机,电镜样品的制备过程,2）负染技术,用重金属盐(如磷钨酸)对铺展在载网上的样品染色；吸去染料，干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸出的地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。,
