菌种及其扩大培养4学时

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1、1,生物反应工程 陈宏文 博士 华侨大学生物工程与技术系,2,第二章 菌种及其扩大培养,引言 种子扩大培养的目的与种子要求 2.1 实验室种子制备 2.2 生产车间种子制备 2.3 影响种子质量的因素 2.4 种子质量控制措施,目前工业规模的发酵发酵罐容积已达几十立方米或几百立方米。如按百分之十左右的种子量计算，就要投入几立方米或几十立方米的种子。 要从保藏在试管中的微生物菌种逐级扩大为生产用种子，是一个由实验室制备到车间生产的过程。 种子液质量的优劣 对发酵生产起着关键性的作用,3,4,种子扩大培养 将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经扁瓶或摇瓶及种子罐

2、逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种。这些纯种培养物称为种子。,5,种子扩培的目的 获得一定数量和质量的纯种 缩短发酵时间、提高设备利用率、保证生产水平,6,种子的要求 活力强，移种至发酵后，能够迅速生长，延迟期短 生理状况稳定 总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求 无杂菌污染 保持稳定的生产能力,7,种子制备一般工艺流程,实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验 室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成。,生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工程上归 为发酵车间管理。,8,21 实验室种子制备,211 种子保藏 212 菌种移接,菌种保藏的意义,菌种 微生物学

3、以及生命科学研究的基本材料 世代时期很短，传代过程中易发生变异、死亡 造成工业生产菌种的退化、使优良菌种丢失。 菌种保藏是微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分 要采用最合适的保存方法使菌种的变异和死亡减少到最低限度,9,10,一般手段 保持培养基营养成分在最低水平 缺氧状态 干燥 低温 菌种保藏方法 斜面冰箱保藏法（低温） 沙土管保藏法（缺营养、低温） 石蜡油封存法（缺氧、低温） 真空冷冻干燥保藏法（缺营养、缺氧、干燥、低温） 液氮超低温保藏法（缺营养、缺氧、干燥、超低温）,2.1.1 种子保藏,斜面冰箱保藏法（低温） 短期、过渡的保藏方法 新鲜斜面接种后，置最适条件下培养到菌体或孢子生

4、长丰满后，放在4C冰箱保存。 一般保存期为三个月到六个月。,11,沙土管保藏法（缺营养、低温） 适合于产孢子或芽孢的微生物。制备方法： 将沙与土洗净烘干过筛后，按沙与土的比例为12：1混合均匀，分装于小试管中，装料高度约为1厘米左右，121C间歇灭菌三次，灭菌试验合格后烘干备用。一般沙用80目过滤，土用80一100目过筛。 将斜面孢子制成孢子悬浮液接入沙土管中或将斜面孢子刮下直接与沙土混合，置干燥器中用真空泵抽干，放在冰箱内保存。一般保存期为一年左右。,12,石蜡油封存法（缺氧、低温） 向培养成熟的菌种斜面上，倒入一层灭过菌的石蜡油，用量高出斜面一厘米，然后保存在冰箱中。此法可适用于不能利用石

5、蜡油作碳源的细菌、霉菌、酵母等微生物的保存。保存期约一年左右。 真空冷冻干燥保藏法（缺营养、缺氧、干燥、低温） 将微生物制成悬浮液，与保护剂混合； 放在特制的安培管，用低温酒精或干冰（-15C），使其迅速冻结，在低温下用真空泵抽干； 最后将安培管真空熔封，井低温保藏。 菌种可以保存很长时间，一般5年左右。,13,液氮超低温保藏法 （缺营养、缺氧、干燥、超低温） 原理：用液氮能长期保存菌种。这是因为液氮的温度可达-196C，远远低于其新陈代谢作用停止的温度(-130C)，此时菌种的代谢活动已停止，化学作用亦随之消失。 操作方法： 安培管的要求 菌种准备及分装 冻结（常温过渡到低温） 重新培养（迅

6、速解冻）,14,15,21 实验室种子制备,211 种子保藏 212 菌种移接,16,1）摇瓶液体培养 ：产孢子能力不强、孢子发芽慢（灰色链霉菌）和不产孢子的菌种（谷氨酸棒状杆菌、酿酒酵母） 2）茄子瓶固体培养 ：产孢子能力强的菌种（产黄青霉菌） 3）茄子瓶斜面培养 ：不产孢子的菌种（细菌）,2.1.2 菌种移接,17,2.2 生产车间种子制备,221 菌种移接 222 种子罐级数的确定 223 接种龄与接种量 224 种子质量判断,18,摇瓶菌丝体：火焰保护接种或压差法 孢子悬浮液：微孔接种法 种子罐之间或发酵罐之间：压差法（由种子 接种管道进行移种，防止接受罐表压降至零， 否则会引起染菌。

7、）,2.2.1 菌种移接,BIOSTAT Aplus The compact, autoclavable fermentor |bioreactor,19,BIOSTAT Bplus Integrated system design for convenience research,21,22,221 菌种移接 222 种子罐级数的确定 223 接种龄与接种量 224 种子质量判断,2.2 生产车间种子制备,23,种子罐级数： 是指制备种子需逐级扩大培养的次数。 种子罐级数确定的依据 级数受发酵规模 菌体生长特性 接种量的大小 级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般2-4级。 在发酵产

8、品的放大中，反应级数的确定是非常重要的一个方面,2.2.2 种子罐级数的确定,24,一级种子罐扩大培养（二级发酵）： 茄子瓶斜面或摇瓶种子经过一次种子罐扩大培养，接入发酵罐作为种子，这称为一级种子罐扩大培养。 如谷氨酸生产菌（生长较快、接种量少）: 茄子斜面 32培养710h 种子罐 发酵罐 摇瓶种子 108109个/ml,2.2.2 种子罐级数的确定,25,二级种子罐扩大培养（三级发酵）： 茄子瓶斜面或摇瓶种子经过两次种子罐扩大培养，接入 发酵罐作为种子，这称为二级种子罐扩大培养。 如青霉素生产菌（生长较慢）： 27 27 孢子悬浮液 发芽罐 繁殖罐 发酵罐 40h 10-24h （50吨）

9、 一级种子罐 二级种子罐,2.2.2 种子罐级数的确定,26,三级种子罐扩大培养（四级发酵）： 链霉素生产菌（更慢） 一级发酵： 孢子或菌丝体直接接入发酵罐中发酵，称一级发酵。 一般是实验室小型发酵罐（5-30L）。,2.2.2 种子罐级数的确定,种子罐的级数越少 越有利于简化工艺和控制 减少由于多次移种而带来染菌的机会 但也必须考虑尽量延长发酵罐生产产物的时间，缩短由于种子发芽、生长而占用的非生产时间，以提高发酵罐的生产率（mol产物/L/h）。 虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定，但也与所选用工艺条件有关。如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖也可相应地减少种子罐的级数。

10、,27,2.2.2 种子罐级数的确定,28,221 菌种移接 222 种子罐级数的确定 223 接种龄与接种量 224 种子质量判断,2.2 生产车间种子制备,在种子罐中，随着培养时间的延长，菌丝量增加、基质消耗及代谢产物的积累，菌丝量不再增加，而逐渐趋于老化。 选择适当的接种龄显得十分重要。,29,2.2.3 接种龄与接种量,30,接种龄： 指种子罐中培养的菌体，移入下一级种子罐或发 酵罐之前在原种子罐中的培养时间。 通常接种龄以菌体处于生命力极为旺盛的对数生长期，且培养液中菌体量还未达到最高峰时为好。 种子过于年轻会出现： （1）前期生长缓慢（2）整个发酵周期延长 （3）产物开始形成时间晚

11、。 种子过于衰老：生产能力下降，引起菌丝过早自溶。,2.2.3 接种龄与接种量,2.2.3 接种龄与接种量,不同品种或同一品种的工艺条件不同，其接种龄是不一样的。 一般要经过多次试验、考察其发酵罐中产量的多少来确定最适的接种龄。,31,接种龄对嗜碱性芽孢杆菌 产碱性蛋白酶的影响,32,接种量：是指移入的种子液体积（V1）和接种后培养液体积（V1+V2）的比例（V1/ V1+V2）。 接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度。 一般接种量：5-15，过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为7-15%。但是一般认为大一点好。,2.2.3 接种龄与接种量,接种量较大：可以缩短发酵罐中

12、菌丝繁殖到达高峰的时间，使产物的形成提前到来。 这是由于种子量多，同时种子液中含有大量体外水解酶类，有利于对基质的利用，并且生产菌迅速被占据了整个培养环境，则对减少杂菌生长的机会。 接种量过多：往往使菌丝生长过快、培养液粘度增加，造成溶解氧不足，而影响产物的合成。 接种量过少：延长发酵周期，往往还会引起其他不正常情况，如产生大量菌丝团，而使产量降低。,33,34,接种量对碱性蛋白酶产生的影响,近年来，生产上多以加大种子量及采用丰富培养基作为获得高产的措施。 获得高产的其它措施： 双种法：两个种子罐接种到一个发酵罐中。卡那霉素生产中采用双种比单种的发酵单位提高8%，而且达到产量高峰的时间提前。

13、倒种法：以适宜的发酵液倒出适量给另一发酵罐作种子，一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。 链霉素酵中，使用倒种法比单种的发酵单位提高19%。而四环素发酵采用双种效果并不显著。,35,36,221 菌种移接 222 种子罐级数的确定 223 接种龄与接种量 224 种子质量判断,2.2 生产车间种子制备,菌种在种子罐中的培养时间较短，可供分析的参数较少，种子的内在质量难以控制。 为了保证各级种子移种前的质量，除了保证规定的培养条件外，在过程中还要定期取样，测定一些参数以观察基质的代谢变化及菌丝形态是否正常。,37,2.2.4 种子质量判断,38,生产中通常测定的参数：,pH值； 磷、糖及氨

14、基氮的含量； 菌丝形态、菌丝浓度、培养液外观（色素、颗粒等）； 其它如酶活等；,用酶活力来判断种子的质量是一种新的尝试。如土霉素 发酵中，种子液的淀粉酶活力与发酵单位有一定关系。,39,表 淀粉液化速度同龟裂链霉菌合成土霉素能力的关系,40,2.3.1 原材料质量 原料质量波动是种子质量不稳定的主要原因 1）产地、品种、加工方法及用量，水质硬 度等； 2）原材料质量波动，起主要作用的是无机离子含量不同。,2.3 影响种子质量的因素,2.3.2 培养条件 1）温度：显著影响斜面孢子质量 2）湿度：对斜面孢子质量有较大影响 3）通气量：需要足够的通气量 2.3.3 孢子斜面冷藏时间,41,42,2

15、.4 种子质量控制措施,种子质量的最终指标：考察其在发酵罐中所表 现出来的生产能力。 首先，必须保证生产菌种的稳定性； 其次，是提供种于培养的适宜环境保证无杂菌 侵入，以获得优良种子。,1）保证生产菌种的稳定性 检查稳定性方法： 取出少许保藏菌种置于灭菌生理盐水中，逐级稀释，在含有琼脂培养基的双碟上涂布培养，菌液稀释度以双碟上所生长的菌落不至过密为宜。挑出形态整齐、孢子丰满的菌落进行摇瓶试验，测定其生产能力，以不低于其原有的生产能力为原则，并取生产能力高的菌种备用。 一般，不管用什么方法保藏菌种，一年左右都应作自然分离一次。,43,44,2）保证无杂菌侵入通常方法： 种子液显微镜观察 种子液无菌试验 主要依据，通过双碟涂布、琼脂斜面划线和 酚红肉汤培养； 生化分析：营养消耗速度、pH变化、溶氧利用、色泽气味等。,45,本章小结,基本概念：种子扩大培养、种子罐级数、一三级种子罐扩大培养（一四级发酵）、接种龄、接种量 种子扩大培养的目的和种子的要求是什么？ 菌种保藏采取了哪些手段？保藏方法有哪些？ 为什么种子要逐级扩大培养？种子罐级数确定的依据是什么？什么情况下可采用一级种子？ 影响种子质量的因素有哪些？ 控制种子质量有哪些措施？,