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1、PCR技术及其应用,谨以此与零点的朋友们交流学习,Contents,PCR原理及其分类,1,常规PCR体系配制与程序设置,2,不同PCR引物设计原则,3,PCR:（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应在体外模拟体内DNA复制的环境配制适当的缓冲体系然后加入各种组分:模板DNA，四种核苷酸，Mg2+,DNA聚合酶，上下游引物，通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环来扩增模板DNA。每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 扩增了特异区段的DNA带。,PCR基本原理,PCR扩增原理,引物,延伸,延伸,
2、5,5,3,3,变性、退火,变性、退火,重复13步 2530轮,目的DNA片段 扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链 与引物复性,DNA变性 形成2条单链,子链延伸 DNA加倍,1）不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究,高浓度引物,低浓度引物,2)反向PCR (reverse PCR),是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。
3、可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。,已知序列,未知序列,未知序列,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,连接酶,3）多重PCR,用于检测特定基因序列的存在或缺失。,电泳,引物,4）LP-PCR（Labelled primers),利用同位素、荧光素等对引物进行标记，用以直观地检测目的基因。 特别适合大量临床标本的基因诊断 可同时检测多种基因成分,病毒1 病毒2 病毒 3 病毒4,标记引物,观察,PCR产物,5）锚式PCR,已知靶基因片段两测的序列,6）原位,原位聚合酶链式反应（
4、In Still PCR，IsPCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段，在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。 直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行扩增。可进行细胞内定位。 适用于检测病理切片中含量较少的靶序列,原位PCR的作用 既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交（ISH），但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于10的情况下，该方法的敏感度就明显下降。而标准的PCR则可扩增出细胞内单拷贝的序列，敏感度很高，但却未能与细胞形态学研究相结合。 ISPCR则可把这两者结合起来，成为细胞学诊断中一
5、种崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内RNA表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。,7）,逆转录酶,聚合酶,mRNA,cDNA,杂化双链,PCR扩增,基因,mRNA,蛋白质多肽链,8)荧光定量PCR,cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5和3末端的有效方法。经典的RACE技术是由Frohman等(1988)发明的一项技术，主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA5和3端，包括单边P
6、CR和锚定PCR,9）RACE技术,cDNA,末端核酸转移酶,3GGGG,5,CCCC 锚定引物,3GGGG,5,CCCC,3GGGG,CCCC,锚定PCR首先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),与同聚物尾配对的3锚定引物（带有限制性内切位点polydC)一起作PCR扩增,巢式PCR（nested PCR），是指利用两套PCR引物（巢式引物）对进行两轮PCR扩增反应。 在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在在内引物的存在下进行第二轮扩增。 由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的引物很少）增加了检测的敏感性；又
7、有两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性。,10)巢式PCR,PCR体系配制与程序设置,1）PCR buffer: 500mM KCl, 100mM Tris-HCl (pH 9.0 ， 25 ), 1% TritonX-100 主要是为反应提供相应的离子环境和酸碱环境 2）dNTP 提供原料 3）Mg2+ Taq酶反应必须二价阳离子 4）引物 特异识别靶标序列，与模板退火 5)模板：质粒，cDNA, 菌液均可以做模板 6）Taq 酶 热稳定的DNA聚合酶,PCR体系各种成分的作用,10PCR buffer: / 5 dNTP 2.5mM/each 4 Mg2+ 25mM/each
8、 3 Up-primer 10nM 1 Down-primer 10nM 1 Hot Taq polymerase 0.5 DNA sample 50ng/l 1-2 ddH2O / 33.5,50l标准PCR反应体系,成分 浓度 体积（l）,1）模板浓度/体积： 一般情况下为了保证PCR效果建议DNA浓度在20ng/ul- 100ng左右，特别是以片段和质粒作为模板，如以菌液作为模板，OD600以0.4-1为宜，过高过低均影响效果。模板的体积不宜超过总体积的1/10。 2）引物体积，由于引物浓度基本恒定，所以只能调节引物体积。以cDNA为模板，使用简并引物时体积可加大，但不宜超过总体积的1/
9、10 如果使用特异引物，以质粒或片段为模板，引物体积一般控制在总体积的1/20左右。 3）Mg2+： Mg2+ 是DNA聚合酶最重要的的激活剂，在一定浓度范围内升高Mg2+ 浓度能促进Taq酶的聚合活性。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降 Mg2+过高影响反应特异性。,可变因子,普通PCR标准反应程序： 94 5min 94 30s 55 30s 72 1min,30循环,1）退火温度 退火温度是调节PCR反应最常用的变量，原则上退火温度越高，特异性越强，引物与模板退火强度越低；退火温度越低，特异性越差，退火强度越高一般退火温度在45-65变动，特殊PCR反应可以更高 2）退
10、火时间 退火时间对PCR结果影响不大，一般如果引物特异性差，3端GC含量低，可以适当延长，但建议在30s-60s范围内变动 3）延伸时间 Taq酶的延伸速度为1000bp/min，延伸时间视目的DNA长度而定。延伸时间过长会引入突变 4）不同类型PCR具体设置,可变因子,引物设计,引物设计是决定PCR反应成败的最关键因子,1. 引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。 2. 引物长度一般在1530碱基之间。引
11、物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。 3.引物GC含量在40%60%之间，Tm值最好接近72。 GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值510。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为5580，其Tm值最好接近72以使复性条
12、件最佳。,引物设计的一般原则,4.引物3端要避开密码子的第3位。 如扩增编码区域，引物3端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。 5.引物3端一般不要选择AT，一般选择G或C。 引物3端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成。而由于GC结合强度大于AT 所以最好选择GC 6. 碱基要随机分布。 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚
13、嘧啶的存在。尤其3端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。,7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。 两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3 端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Cross dimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。 引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓
14、度而使PCR 反应不能正常进行。 8. 引物5 端和中间G值应该相对较高，而3 端G值较低。 G值是指DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，G值越大，则双链越稳定。应当选用5 端和中间G值相对较高，而3 端G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3 端的G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。（不同位置的G值可以用Oligo 6软件进行分析）,9.引物的5端可以修饰，而3端不可修饰。 引物的5 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5 端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu
15、3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。 引物的延伸是从3 端开始的，不能进行任何修饰。3 端也不能有形成任何二级结构可能。 10. 扩增产物的单链不能形成二级结构。某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（G）小于58.6l kJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。 11. 引物应具有特异性。引物设计完成以后，应对其进
