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1、第二章 基因工程及其在食品科学中的应用,基因工程基础 基因工程研究方法 基因工程在食品科学中的应用,第一节 基因工程基础,一、基因工程的定义、意义及研究内容 (一)基因工程的定义 gene engineering genetic engineering recombinant DNA technique Molecular cloning (二)基因工程的意义 基因工程是现代生物工程的主体核心技术。基因工程的最大特点是可打破生物种属界限,进行生物种(属、科、目、纲、门、界)内外基因的重组、遗传信息的转移。 遗传病、心脑血管病、糖尿病、癌症过度肥胖综合症、老年痴呆症、骨质疏松症,(三)基因工程的
2、研究内容,制备目的基因,构建重组DNA,获得转化体,筛选出重组转化体阳性克隆,筛目的基因在受体生物 细胞中高效表达隆,二、基因工程的工具酶 基因工程的关键技术之一就是先将目的基因DNA从供体生物体中分离出来,再与合适载体DNA连接重组等,这些分子操作涉及多种不同的酶。主要包括: 限制性内切核酸酶 DNA甲基化酶、 DNA聚合酶 依赖于DNA的RNA聚合酶 连接酶 激酶 磷酸酶 核酸酶,(一)限制性内切核酸酶与DNA甲基化酶 1、定义 restriction endonuclease:指一类能够识别和切割双链DNA分子内核苷酸序列的内切核酸酶 DNA methylase :是指一类能够识别DNA
3、特定序列,并在其特定碱基的特定位置上引入甲基而发生修饰作用的酶 2、限制性酶(甲基化酶)的命名和分类 (1) 限制酶(甲基化酶)的命名 其命名主要是参照HOSmith和D. Nathans提出的待命名酶的供体微生物的属名与种名相结合的原则进行的,具体如下:, 以属名的第一个字母(大写)和种名的最前两个字母(小写)组成的三字母符号为其基本形式 如:来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的酶用Eco表示;来源于流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)的用Hin表示 当同属不同种的两种微生物的种名前两个字母完全相同时,则来自后一种微生物的酶的符号改用其种名词头前缀后第一
4、个字母(小写)代替上述三字母符号中的最后一个字母 如:来自Haemophilus parainfluenzae (副流感嗜血杆菌)的用Hpa表示,而来自同一属的Haemophilus parahaemolyticus (副溶血嗜血杆菌)的则用Hph表示。, 当微生物具有特殊名称时,则将代表该特殊名称的符号置于上述三字母符号之后 如:来自Haemophilus influenzae的Rd株的用Hind表示;来自Haemophilus influenzae的Rf型的用Hinf表示。 当不止一种限制酶(甲基化酶)分离纯化自同一微生物株系时,则依其被分离的先后顺序以罗马数字(大写)置于上述命名符号之后
5、 如:来自Haemophilus aegytius的三种酶分别用Hae I、Hae和Hae表示;来自Haemophilus influenzae的Rd株的三种酶分别用Hind I、Hind和Hind表示。, 为了区别起见,在上述命名名称之前加R表示限制酶类;在上述命名名称之前加M表示甲基化酶类 如:来自Haemophilus influenzae的Rd株的第三种限制性内切核酸酶为R. Hind,其相应的DNA甲基化酶则为M. Hind。,大鼠生长激素基因转入小鼠,(2) 限制酶的分类 根据酶的性质,可将限制酶分为三个类型: I型: 三种不同亚基组成;辅助因子为ATP、Mg2+及S-腺苷甲硫氨酸
6、 其切割位点距其识别位点至少1000bp;且切割作用是随机的 型: 两个相同亚基组成;辅助因子仅为Mg2+;其识别位点常具旋转 对称性;其切割位点与其识别位点重叠或在其附近;且切割作 用特异性强 型: 两种不同亚基组成;辅助因子为ATP和Mg2+,也受S-腺苷甲硫 氨酸激活,但并非必需;其切割位点一般在距其识别位点3端 2426bp处,PstI 5-C TGCA G-3 3-G ACGT C-5 HpaI 5-GTT AAC-3 3-CAA TTG-5,限制性内切酶的旋转对称性,需要指出的是,I型和型限制性内切核酸酶均兼具限制酶活性和甲基化酶活性;而对型限制性内切核酸酶而言,其只具限制酶活性,
7、与其相应的DNA甲基化酶才具甲基化酶活性。型限制性内切核酸酶及其相应的DNA甲基化酶对DNA有相同的识别序列。,(3)型限制性内切核酸酶的基本特性 识别序列与切割位点 型限制性内切核酸酶可识别长度为47bp的双链DNA特定序列,该识别序列(识别位点)常呈旋转对称性 切割方式 平齐末端 、5磷酸端25个核苷酸突出单链黏性末端 、3-羟基端25个核苷酸突出单链黏性末端,型限制性内切核酸酶切割方式, 同裂酶与同尾酶 isoschizomer :在型限制性内切核酸酶中,来源不同而识别序列和切割方式均相同者 如:Hpa和Msp I两者的识别序列都是CCGG,切割方式也相同,因此二者为同裂酶 isocau
8、damer :来源及识别序列不同,但DNA经其切割后能形成相同黏性末端者 如:BamH I、Bcl I、Bgl、Mbo I、Sau3A I及Xho切割DNA后都形成相同的GATC四核苷酸突出单链黏性末端,因此其为一组同尾酶 需要指出的是,由同尾酶切割DNA所得到的黏性末端可以彼此连接起来,但是不能重新切开,即原来同尾酶的识别序列都已不再存在。, 限制性片段长度与切割频率 经限制性内切核酸酶切割后产生的DNA片段称为限制性片段(restriction fragment)。一般不同限制酶切割DNA后所形成的限制性片段长度不一 假设在某DNA分子中,A或T出现的频率为X,G或C出现的频率为Y,那么某
9、限制酶在该DNA分子上的切割位点出现频率(切割频率或位点频率) F可用下式表示: F=XnYm 式中:n该限制酶识别序列中双链A=T碱基对的数目;m该限制酶识别序列中双链G=C碱基对的数目,如果构成某DNA分子的碱基对总数目(B)及某限制酶识别位点核苷酸序列均为已知,那么该限制酶在该DNA分子上的理论切割位点数目(N)为: N=BF 假定在某DNA分子中四种核苷酸残基数量相等,那么识别序列为四个碱基对的限制酶在该DNA分子中切割位点出现频率为(14)4,即1256,也即平均256个碱基对出现1个切割位点。 同样,识别序列为六个碱基对的限制酶在该DNA分子中切割位点出现频率为(14)6,即140
10、96,也即平均4096个碱基对出现1个切割位点。 需要指出的是:实际情况与理论不相符,(4) 影响限制性核酸内切酶活性的主要因素及优化策略 底物DNA制备物的纯度:蛋白质、SDS、EDTA、酚、氯仿、乙醇及高浓度的盐离子等污染物都会抑制限制酶的活性。 底物DNA的甲基化程度:大肠杆菌的绝大多数菌株含有两种DNA甲基化酶:a、dam甲基化酶;b、dcm甲基化酶。 底物DNA的结构构型:环状双螺旋DNA较线性DNA稳定。因此,在用限制性酶酶解同样分子量的DNA时,环状双螺旋DNA所需酶量为线性DNA的1020倍。 酶反应缓冲液的组成: 酶反应的最适温度:,为了提高限制酶对底物DNA低纯度制备物的反
11、应效率,一般采用如下方法: a 增加限制酶的用量(平均每g底物DNA可用10IU甚至更多些); b 延长酶催化反应的保温时间,使酶解更完全; c 扩大酶催化反应的体积,使潜在的抑制因素被稀释,以减弱其抑制作用; d 在反应液中加入适量亚精胺(一般应用浓度为12.5mmolL),以利限制酶对基因组DNA的酶解作用。,(5) 限制性内切核酸酶酶解反应的操作步骤及注意要点 (二) DNA聚合酶 最常用的依赖于DNA的DNA聚合酶有大肠杆菌DNA聚合酶I(全酶)、大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)、T4噬菌体编码的DNA聚合酶、耐热的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)等 依赖于RNA的D
12、NA聚合酶,即逆转录酶,优先以RNA为模板,也可以DNA为模板,因此该聚合酶能以RNA为模板催化合成双链DNA,1、大肠杆菌DNA聚合酶I(全酶) 来源:大肠杆菌; 分子量:109103的多肽链 (1)作用 具有53DNA聚合酶活性,以单链DNA为模板,以带3自由羟基的DNA片段为引物; 53外切核酸酶活性,从5端既降解双链DNA,也降解RNA-DNA杂交体中的RNA链(RNA酶H活性); 35外切核酸酶活性,底物为带3自由羟基的双链DNA或单链DNA。 (2)主要用途 以切刻平移法(nick translation)标记DNA。在所有聚合酶中,只有该酶能用于此反应,因为只有其具有53外切核酸
13、酶活性。 对DNA分子的3突出尾进行末端标记。,DNA 聚合酶,2、大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(Klenow片段) 来源:由大肠杆菌DNA聚合酶I全酶经枯草杆菌蛋白酶酶解获得,也可通过克隆技术获得。 分子量:76103的多肽链 (1)作用 53DNA聚合酶活性,以单链DNA为模板,以带3自由羟基的DNA片段为引物; 35外切核酸酶活性,底物为带3自由羟基的双链DNA或单链DNA。 (2)主要用途 补平限制酶切割双链DNA所产生的3凹端; 如果以标记的dNTP补平双链DNA的3凹端,那么可对DNA分子进行末端标记; 对DNA分子的3突出尾进行末端标记; 在cDNA克隆中,合成cDNA第二链;
14、应用Sanger双脱氧链末端终止法进行DNA测序。,Klenow 酶的作用方式,3、T4噬菌体DNA聚合酶 来源:T4噬菌体感染的大肠杆菌 分子量:114103 (1)作用 53DNA聚合酶活性,以单链DNA为模板,以带3自由羟基的DNA片段为引物; 35外切核酸酶活性,底物为带3自由羟基的双链DNA或单链DNA; (2)主要用途 补平限制酶切割双链DNA产生的3凹端; 如果以标记的dNTP补平双链DNA的3凹端,那么可对DNA分子进行末端标记; 对DNA分子的3突出尾进行末端标记,并且该酶为利用此法进行此类末端标记的首选酶; 将双链DNA的突出端转化成平齐端。在制备与合成接头连接的双链DNA
15、时,经常利用这一特性。,4、TaqDNA聚合酶 来源:水生栖热菌(Thermus aquaticus),现可由基因工程途径来生产 分子量:65103,是一种非常耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶。 (1)作用 具有53DNA聚合酶活性,以单链DNA为模板,以带3自由羟基的DNA片段为引物。 (2)主要用途 对DNA进行测序; 通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)对DNA分子的特定序列进行体外扩增。,5、逆转录酶(依赖于RNA的DNA聚合酶) 来源:一种来自禽成髓细胞瘤病毒(AMV),分子量为170103; 一种来自能表达克隆化的Moloney鼠白血病病毒(Mo-MLV)逆 转录酶基因的大肠杆菌,分子量为84103。 (1)作用 (2)主要用途 6、末端脱氧核苷酸转移酶(末端转移酶) 来源:小牛胸腺 分子量:60103 (1)作用 (2)主要用途,(三) 依赖于DNA的RNA聚合酶 1、SP6噬菌体RNA聚合酶 来源:SP6噬菌体感染的鼠伤寒沙门氏菌LT2株。 (1)作用 该酶主要具有一种活性,即53 RNA聚合酶活性,识别双链DNA模板上相应的噬菌体特异性启动子,并且以此双链DNA为模板合成RNA。 (2)主要用途 合成单链RNA,制