《人类基因组》ppt课件

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1、人类基因组 THE HUMAN GENOME,组长：蒋蓉 组员：吴兰兰 田会会 覃振萍 周辉 范艳霞,CONTENTS,THE HUMAN GENOME & HGP APPLICATION PROSPECT,基因组：生物体内遗传信息的集合，是某个 特定物种细胞内全部DNA分子的总和。,人类基因组：包括24条染色体，约有30亿 对核苷酸，编码了5万-6万个基因，人类基因组携带了有关人类个体发育、生老病死的全部遗传信息。,人类基因的基本数据,人类基因组包括 24条染色体，3109bp， 平均每基因碱基数为3000，最大的dystrophin基因包含240万碱基。 基因总数为2-2.5万，远低于原估

2、计的8-14万。 不同个体的碱基顺序有99.9%相同。 已发现的基因中约有一半功能未知。,人类基因的分布,确定人类基因组所携带的全部遗传信息，认识自我，揭开人类生长发育的奥秘，追求健康，战胜疾病，是人类基因组计划（HGP）的最终目标。,HGP (Human Genome Project),1986199020002003 NIH&DOE 15年 30亿$ 六个国家 1999 1%,划时代,人类基因组计划研究概况,1986年: Dulbecco R , 癌症研究的转折点人类基因组的全序列分析 1990年10月1日: “人类基因组计划” 正式启动 2000年6月26日: 人类基因组工作框架图构建完

3、成 2001年2月15日: （Initial sequencing and analysis of the human genome）,HGP主要任务及内容,这张解剖图包括4张小图，包括了人类基因组计划的全部主要内容，它们分别是遗传图（连锁图）、物理图、序列图和转录图,第一张图是遗传图，又叫连锁图。它是以在某个遗传位点上具有多个等位基因的遗传标记作为“路标”，以遗传学上的距离即两个遗传位点之间进行交换、重组的百分率cM作为“图距”，反映基因遗传效应的基因组图。 （1厘摩=重组频率为1%的两个基因间的遗传距离） 建立人类遗传图的关键是要有足够的高度多态的遗传标记 RFLP(限制性片段尺度多态性)

4、 STR重复序列 SNP(单核苷酸的多态性）,物理图是基因组计划的第二张图。物理图以一个“物理标记”作为路标，以Mb、Kb、bP作为图距的基因组图。物理图与遗传图相互参照就可以把遗传学的信息转化为物理学信息。这样，物理图就把人类庞大基因组分成具有界标的1500个小区域。 第三张图是序列图，可以说它是人类基因组在分子水平上最高层次、最为详尽的物理图。测定总长为1米、由30亿对核昔酸组成的基因组全部DNA序列，是基因组计划中最为明确、最为艰巨的定时、定量、定质的硬任务。,第四张图是转录图。 我们知道，生物性状是由结构或功能蛋白决定的，功能蛋白是由信使RNA（mRNA）编码的，mRNA又是由编码蛋白

5、功能基因转录而来的。转录图就是测定这些可表达片段（EST）的标记图。,测序,HGP大大推进了基因组测序技术的进步，反过来，更先进的基因组测序技术运用于HG P中，也加快了人类了解自身的速度。,测序方法和策略,逐步克隆法 (clone by clone approach) 全基因组随机测序方法散弹法（shotgun）,测序方法,测序策略,自动化链终止法测序,“逐个克隆法”策略 公共领域测序,即先复制更大段的人类基因序列，对连续克隆系中排定的BAC（细菌人工染色体）克隆逐个进行亚克隆测序并进行组装（公共领域测序计划），然后将它们绘制到基因组的适当区域，这种方法需要研究人员在早期把较多的时间和精力放

6、到克隆和绘制草图上，,基因组序列工作框架图,工作：通过对染色体位置明确的BAC连续克隆系4-5倍覆盖率的测序，获得基因组90%以上的序列，其错误率低于1%。 用途：对基因组结构的认识，基因的认识和解析，疾病基因的定位克隆，单个核苷酸的多态性发现。,两个阶段 大规模测序与序列组装工作框架图构建 基因组DNA文库构建和质量检测（ LanderWaterman曲线） 大规模测序 序列组装（assembly） 基因组序列完成图的绘制 通过contig末端测序反应确定关系 大插入片段文库，如文库或Cosmid文库等 肽链连接法 随机组合进行PCR反应,全基因组随机测序方法散弹法 美国Celera公司,L

7、arge-scale genome projects,Sequencing DNA molecules in the Mb size range All strategies employ the same underlying principles: Random Shotgun sequencing,Complete sequence,Shotgun reads,Contigs,Genomic DNA,Shearing/Sonication,Subclone and Sequence,Assembly,Finishing,Finishing read,原理示意,染色体,Plasmid 2-

8、 10 kb,BAC 100kb,基因组 DNA,测序,组装,基因组序列,文库构建,散弹法全基因组随机测序技术流程,散弹法基本步骤-1,1. 目的基因组DNA片段的制备 分离和纯化基因组DNA时，通常采用蛋白酶分解和有机相抽提的方法除掉蛋白质及脂类等其他大分子。基因组DNA片段化则主要采用物理剪切法和限制性内切酶法。,2. 外源DNA片段的全克隆 选择适宜的载体，与外源DNA片段相连。 常用的载体有质粒、噬菌体、粘粒（cosmid）以及YAC。这些载体可以克隆的DNA片段长度上限分别约为1.5-3、10、23、45和1000kb。 选择载体的主要参数是基因组大小，即基因组DNA序列的长短。 例

9、如，构建大肠杆菌（4.6Mb）等基因组较小生物的基因组文库时，采用质粒作为载体便可得到满意的结果：按每个DNA片段平均长5kb计算，一个包括5000个DNA片段克隆的基因文库就能够代表一个完整的大肠杆菌基因组序列。构建较大基因组的文库时，噬菌体、粘粒以及YAC常被选作克隆载体。 通过转化或转导的方法将带有不同DNA片段的重组DNA分子导入受体细胞，获得一套包含特定生物体所有DNA序列的克隆。,散弹法基本步骤-2,3.期望重组子的筛选 很多方法能帮助我们从基因文库的众多克隆中筛选和鉴定带有特定基因的克隆，它们大多是以杂交探测技术（hybridization probing）为基础的。 杂交探测是

10、一种利用能和目的基因序列互补的DNA或RNA片段为探针，通过分子杂交的手段找出带有目的基因的DNA片段的实验方法。 用菌落（菌斑）原位杂交或免疫原位检测法可快速筛选基因文库。一般采用三步甚至两步筛选法，可以在短时间内完成全基因文库的筛选，其程序为： 首先制备高密度平板，使每块平板密集分布5000-10000个菌落或噬菌班，进行原位杂交； 由感光胶片上的斑点位置在原杂交阳性平板的相应区域挖下固体琼脂，用新鲜培养基洗涤稀释； 将稀释液再次涂布平板，使每块平板只含有200-500个可辨认的菌落(斑)； 用相同的探针进行二轮杂交，直至准确挑出期望的重组克隆。,散弹法基本步骤-3,常用的拼接软件, Ph

11、rap (http:/www.genome.washington.edu/UWGC/analysistools/Phrap.cfm),http:/ 拼接结果显示（Consed界面）,序列的组装,序列组装原理：直接从已测序的小片段中寻找彼此重叠的测序克隆,然后依次向两侧邻接的序列延伸. 优点：不需预先了解任何基因组的情况.,A,B,C,A,B,C,A,B,C,A,B,C,小片段测序,计算机拼装,Consensus,Mis-Assembly (Inverted),Find overlaps,Contig sequence construction,Highest weight path throu

12、gh the graph Tarjan algorithm Contig sequence derived from read segments that occur on the path,A,B,C,小片段测序,计算机拼装,散弹法测序的问题,CAATGCATTA GCAGCCAATGC,GAP,错装,完成（Finishing）,Assembly: Process of taking raw single-pass reads into contiguous consensus sequence Closure: Process of ordering and merging consens

13、us sequences into a single contiguous sequence Finished is defined as sequenced on both strands using multiple clones. In the absence of multiple clones the clone must be sequenced with multiple chemistries. The overall error rate is estimated at less than 1 error per 10 kb,各重叠群间仍有间隙 顺序间隙 物理间隙 ,载体或宿

14、主菌 选用不当而被丢失的顺序,测序时遗漏的测序,解决办法:通过相邻已知顺序作为探针筛选已有的基因组文库,解决办法:利用其它宿主菌与载体重新构建文库,两种测序的结果比较分析：,两个研究组将数据进行的对比以及人类基因组工程的科学家、科学和自然杂志高级指导编辑的评估表明，塞莱拉公司的基因组分析与人类基因组计划的分析结果虽然存在一些差异，但大部分地方都有极高的吻合度。,测序技术也在不断地发展和提高。过去几年内，通过在一个测序的电泳胶上增加电泳泳道和测序胶的长度，使自动测序仪的通读水平提高了23倍。 毛细管电泳技术(CE,capillary electrophoresis) 此外，一些不依赖于电泳技术来分离DNA片段的方法如质谱分析也正在或已经建立。杂交测序也是一项非电泳类方法。目前还有一种可用电子显微镜直接观察的方法。,人类基因组研究成果表明,基因数量少得惊人 人类基因组中存在“热点”和大片“荒漠” 三分之一为“垃圾”DNA 种族歧视毫无根据 男性基因突变比