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1、第五章 PCR引物设计,研究领域：基因克隆、测序、重组 疾病诊断 法医鉴定 亲子鉴定 古生物学研究,PCR技术的应用,PCR及其衍生技术,兼并引物PCR RACE 反向PCR（IP-CR） 差异展示PCR(DD-PCR) 多重PCR TD-PCR PCR-SSCP Net-PCR IC-PCR Hotstart PCR SPA,RAPD Real time PCR LD-PCR Tall-PCR Marathon PCR 原位PCR RT-PCR 不对称PCR Overlapping PCR ,PCR原理,高温变性 低温退火 适温延伸,理论上，只要知道任何一段模板序列，就能按其设计互补的寡核苷
2、酸链做引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。,PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。引物是PCR特异性反应的关键。,PCR引物,是人工合成的两段寡核苷酸。一个与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。,引物最好在模板cDNA的保守区内设计 保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。 同时应预测将扩增的片段单链是否形二级结构。如这个区域单链能形二级结构，就避开它。如这一段不能形二级结构，那就可
3、以在这一区域设计引物。,若不能避开这一区域时，用7-deaza-2-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。,1、引物设计的原则,引物要跟模板紧密结合； 引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在； 引物不能在别的非目的位点引起高效DNA聚合反应(即错配)。,引物设计需要考虑的因素,引物长度（primer length） 产物长度（product length） 序列Tm值 (melting temperature) G值 (internal stability) 引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin） 错误引发位点（false primin
4、g site） 引物及产物GC含量（composition） 有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。,引物设计要点（1）,引物长度: 一般，引物的长度为16-23bp，常用的长度为18-21bp。,PCR产物长度 500bp 引物长度 16 18 bp PCR产物长度 5kb 引物长度 25bp PCR纪录： 23bp长度引物 扩增出 40kb产物,引物设计要点（2）,引物3端 引物3端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高，而其它三种碱基的错误引发效率相对小一些。 3端防止连续三个C或G 3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，3端不能进行
5、任何修饰，也不能有形成任何二级结构可能， 扩增编码区域，引物3端不要终止于密码子的第3位?,因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。,引物的5端 引物的5端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。 引物5端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。,引物的GC含量一般为45-55%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。,引物设计要点（3）,引物的Tm值。Tm值最好接近72。过高（72）或过低（37）都不利于引发反应。上下游引物的Tm 不能相差太大。 长
6、度为25mer以下的引物：Tm = 4(G + C)+ 2(A + T),对于更长的寡聚核苷酸， Tm = 81.5 + 16.6 x Log10Na+ + 0.41 (%GC) 600/size 公式中，Size = 引物长度。 PCR退火温度为Tm-5 ,计算Tm 值时并 不包括5端修饰序列,选用5 端和中间G值相对较高，而3 端G值较低（绝对值不超过9）的引物。 G值是指DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，G值越大，则双链越稳定。 G值反映了引物与模板结合的强弱程度,引物设计要点（4）,引物与模板应具有较高的结合能量，这样有利于引物与模板序列的整合。因此
7、，5端与中间段的G值应较高，引物3端的G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。,算法：邻近热力学,例：ACGG 和其互补 TGCC 结合的G： G(ACGG)= G(AC)+ G(CG)+ G(GG) = -(1.3+3.6+3.1) = -8.0 kcal/mol,引物设计要点（5）,可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高，错误引发的引发率一般不要高过100，最好没有错误引发位点，如此可以保证不出非目的产物的假带。,错配（或称假引发）：将导致产生非专一产物,引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带
8、，且会降低引物浓度从而导致PCR正常反应不能进行。,引物设计要点（6）,1、发夹结构（Hairpin） 自身互补 2、二聚体（Dimer） 两个引物间互补,对引物的修饰一般是增加酶切位点，应参考载体的限制酶识别序列确定，常常对上下游引物修饰的序列选用不同限制酶的识别序列，以有利于以后的工作。,引物设计要点（7）,基因中不能含有任何选择的酶切位点序列 酶切位点加在上下游引物的5端 保护碱基的设置 所有酶切位点都要加上适当的保护碱基，不同的保护碱基切割效率不同。,末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开， 因此人为的在酶切位点序列的5端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的
9、活性。,先设计引物，对其退火温度和GC含量评价，完后直接在引物前加上酶切位点就OK了,引物是 5-GGGGGAAAATTTTTCCC CCCTTTTAAATTT-3 EcoI 是GAATTC 保护碱基CCGGAATTCCGG 加酶切位点的引物为 5-CCGGAATTCGGGGGAAAATTTTTCCC CCCTTTTAAATTT-3,2、引物的自动搜索和评价分析,软件的引物设计功能主要体现在2个方面：首先是引物分析评价功能，该功能只有少数商业版软件能够做到，其中以“Oligo 6”最优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果也不尽相同。自动搜索功能以“Pr
10、emier Primer”为最强且方便使用，“Oligo 6”其次，其他软件如“Vector NTI Suit”、“Dnasis”、“Omiga”和“Dnastar”都带有引物自动搜索功能，但搜索结果不是十分理想。 要想得到效果很好的引物，在自动搜索的基础上还要辅以人工分析。一般认为引物设计软件的最佳搭配是“Oligo”和“Premier”软件合并使用，以“Premier”进行自动搜索，“Oligo”进行分析评价，如此可快速设计出成功率很高的引物。,3、引物设计软件,常用的引物设计软件 Primer Premier 5 Oligo 6 WONDERFUL生物信息学系统,Primer Premi
11、er 5.0的使用技巧简介,引物设计 限制性内切酶位点分析 motif查找 同源性分析功能 序列“朗读” DNA与蛋白序列的互换 简并引物设计功能,功能：,简并引物： 有时需要根据一段氨基酸序列反推到DNA来设计引物，由于大多数氨基酸的遗传密码不只一种，由氨基酸序列反推DNA序列时，会遇到部分碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物，它们的序列组成大部分相同，但在某些位点有所变化，称之为简并引物。,简并度的计算：,例如“, Ala Asn Ile Lys Met”的引物 Ala = 4, Asn = 2, Ile = 3, Lys = 2, Met= 1 4 2 32 1
12、= 48,使用步骤及技巧,Preimer Premier 启动界面,复制序列粘贴到此处,进行引物设计时，点击 按钮,如果没有特殊要求，建议使用默认设置。,5对引物,每对产物的大小,引物分值 100分为满分,该图分三部分，最上面是图示PCR模板及产物位置，中间是所选的上下游引物的一些性质，最下面是四种重要指标的分析，包括发夹结构（Hairpin），二聚体（Dimer），错误引发情况（False Priming），及上下游引物之间二聚体形成情况（Cross Dimer）。当所分析的引物有这四种结构的形成可能时，按钮由 变成 。,点击该按钮 ，在左下角的窗口中就会出现该结构的形成情况。一对理想的引物
13、应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有 ，只有 。值得注意的是中间一栏的末尾给出该引物的最佳退火温度，可参考应用。,5加入酶切位点,设计简并引物,Premier Primer 5提供了8种生物遗传密码使用的偏好选择 1、纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear） 2、无脊椎动物线粒体（Invertebrate Mitochondrion） 3、支原体（Mycoplasma） 4、植物线粒体（Plant Mitochondrion） 5、原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion） 6、一般标准（Standard） 7、脊椎动物线粒体（Ve
14、rtebrate Mitochondrion） 8、酵母线粒体（Yeast Mitochondrion）,注意事项,(1) 选择简并性低的氨基酸区域。,(2) 根据生物使用密码子的偏性，选择使用率最高的密码子，进一步限定引物的简并度。,(3) 引物的3端不应存在简并。,整体评价,该软件是一款功能全面的引物设计软件，全面地给出了各种参数，并在多个必须的地方给出有效的评价。但是程序在设计中还有一些不足。 如：产物的Tm值和引物的Tm值之间的差异也未能给出评价，如果二者差异较大（22度），则容易造成退火时引物-模板和模板-模板火之间的竞争。 结果输出方面，只能以图文格式打印，无法转成文本格式,htt
15、p:/218.242.234.226/wanshan/wlzy.htm,解压密码： 在Win.ini中把vspace=DU改为vspace=PU便可以使用全部功能,Oligo 6.71使用技巧简介,功能 在专门的引物设计软件中，“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分复杂，但初学者容易被其复杂的图表吓倒。其初始界面有3个图：Tm图、G图和Frq图（其中Frq是6.22版本的新功能，为邻近6至7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性）。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。,使
16、用,Oligo 6.71的启动界面如下：,G值反映了序列与模板的结合强度，最好引物的G值在5端和中间值比较高，而在3端相对低。 Tm值曲线以选取72附近为佳，5到3的下降形状也有利于引物引发聚合反应。 Frq是邻近6至7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。Frq曲线揭示了序列片段存在的重复机率大小。该频率高则增加错误引发的可能性。 选取引物时，宜选用3端Frq值相对较低的片段。,在设计时，可依据图上三种指标的信息选取序列，如果觉得合适，可点击Tm图块上左下角的Upper按钮 ，选好上游引物，此时该按钮变成 ，表示上游引物已选取好。下游引物的选取步骤基本同上，只是按钮变成Lower。,当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价。,首先，检查引物二聚体尤其是3端二聚体形成的可能性。,第二项检
