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1、(10)申请公布号 CN 102268468 A(43)申请公布日 2011.12.07CN102268468A*CN102268468A*(21)申请号 201110202703.9(22)申请日 2011.07.20C12P 19/14(2006.01)C12R 1/125(2006.01)C12R 1/085(2006.01)(71)申请人上海海洋大学地址 201306 上海市浦东新区沪城环路999号182信箱(72)发明人汪立平 穆昭艳 冷向军 赵勇(74)专利代理机构上海硕力知识产权代理事务所 31251代理人王法男(54) 发明名称一种利用啤酒废酵母制备甘露寡糖的方法(57) 摘要
2、本发明公开了一种利用啤酒废酵母制备甘露寡糖的方法，涉及饲料添加剂技术领域。针对现有的以-甘露聚糖酶水解植物多糖制备甘露寡糖，生产成本高的问题。本发明的制备方法步骤如下：（1）由啤酒废酵母制得酵母细胞壁液体或固体；（2）制备异甘露聚糖酶粗酶液；（3）将经步骤（2）制得的异甘露聚糖酶粗酶液加入经步骤（1）制得的酵母细胞壁液体或固体中水解制备甘露寡糖。本发明的方法用于生产可作畜禽及水产饲料添加剂的甘露寡糖。(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书 2 页 说明书 5 页CN 102268475 A 1/2页21.一种利用啤酒废酵母制备甘露寡糖的方法，包
3、括如下步骤：（1）由啤酒废酵母制得酵母细胞壁液体或固体；（2）制备异甘露聚糖酶粗酶液；（3）将经步骤（2）制得的异甘露聚糖酶粗酶液加入经步骤（1）制得的酵母细胞壁液体或固体中,进行水解制备甘露寡糖。2.根据权利要求1所述的一种利用啤酒废酵母制备甘露寡糖的方法，其特征在于：所述步骤（1）中制备酵母细胞壁液体和固体的步骤如下：（a）啤酒废酵母预处理：将洗涤后的啤酒废酵母进行离心分离得到酵母泥；（b）制备酵母细胞壁液体：将质量浓度为50g/L150 g/L的酵母泥、质量浓度为400g/L500g/L的醋酸-醋酸钠缓冲液和蒸馏水混合，将制得的混合液置入密封容器中，搅匀后静止0.5h1h，并在温度30C
4、80C下，水浴加热12h48h；酵母泥、醋酸-醋酸钠缓冲液和蒸馏水三种物料按1:3.5:4.5配比组成；（c）制备酵母细胞壁固体：将经步骤（b）制得的酵母细胞壁液体进行离心分离，弃上清液，将沉淀部分在温度40C80C下干燥12h48h，制得酵母细胞壁固体。3.根据权利要求2所述的一种利用啤酒废酵母制备甘露寡糖的方法，其特征在于：所述步骤（b）中所述醋酸-醋酸钠缓冲液是将质量浓度分别为2.4g/L的醋酸、109.2g/的醋酸钠、20g/L的氯化钠和1L蒸馏水混合制得，所述醋酸-醋酸钠缓冲液的pH值为6。4.根据权利要求1所述的一种利用啤酒废酵母制备甘露寡糖的方法，其特征在于：所述步骤（2）中制备
5、异甘露聚糖酶粗酶液的步骤如下：（a）制备种子培养基溶液和发酵培养基溶液；按如下质量份的原料制备种子培养基溶液：酵母细胞壁 0.5g20g、蛋白胨 1g40g、氯化钠 0.5g20g、水1000 ml，种子培养基溶液pH值为5.08.0；按如下质量份的原料制备发酵培养基溶液：酵母细胞壁 0.5g20g、蛋白胨 1g40g、氯化钠 0.5g20g、水1000ml，发酵培养基溶液pH值为5.08.0；（b）种子液的制备：将枯草芽孢杆菌菌株接种到经步骤（a）制得的种子培养基中，在温度25C45C下培养12h72h，按质量浓度为10g/L200g/L的接种量接种到经步骤（a）制得的发酵培养基培养，振荡器
6、中温度为25C45C、振荡频率为100 r/min250r/min，振荡培养时间为12h72h，制得发酵液； （c）异甘露聚糖酶粗酶液的制备：对经步骤（a）制得的发酵液进行离心分离，取上清液制得异甘露聚糖酶粗酶液。5.根据权利要求1 所述的一种利用啤酒废酵母制备甘露寡糖的方法，其特征在于：所述步骤（3）中甘露寡糖的制备步骤如下：取质量浓度为200g/L700g/L的异甘露聚糖酶粗酶液加入质量浓度为10g/L200g/L的酵母细胞壁液体制得混合液，所述混合液pH值为58，水解温度为30C80C，水解时间为2h10h，水浴加热所述混合液至粘稠状，在30C100C下烘干至恒重，粉碎制得甘露寡糖粉末。
7、6.根据权利要求5 所述的一种利用啤酒废酵母制备甘露寡糖的方法，其特征在于：所述异甘露聚糖酶粗酶液和酵母细胞壁液体的混合液的pH值为5-8 。7.根据权利要求5 所述的一种利用啤酒废酵母制备甘露寡糖的方法，其特征在于：所述混合液的水解温度为30-70C，水解时间为3-7h。权 利 要 求 书CN 102268468 ACN 102268475 A 2/2页38.根据权利要求 4所述的一种利用啤酒废酵母制备甘露寡糖的方法，其特征在于：枯草芽孢菌株也可为安全性蜡样芽孢杆菌或其他分泌异甘露聚糖酶的安全微生物替代。权 利 要 求 书CN 102268468 ACN 102268475 A 1/5页4一
8、种利用啤酒废酵母制备甘露寡糖的方法技术领域0001 本发明涉及饲料添加剂技术领域，尤其涉及一种利用啤酒废酵母自溶并添加微生物酶制备甘露寡糖的方法。背景技术0002 我国的啤酒工业经过近几十多年的迅猛发展，目前啤酒生产厂家已发展至800多家。自2001年以来，我国已成为世界上第一大啤酒生产国，而且啤酒产量每年还在以57的速度增长。2010年，啤酒生产量已达到4483万吨。啤酒废酵母是啤酒生产中的重要副产物，酵母泥的产量约占啤酒总产量的2%3%。每年我国啤酒生产企业排弃的废酵母泥多达90万吨135万吨。啤酒废酵母的主要成分为蛋白质、多糖、核酸、维生素、微量元素和酶，其中多糖主要存在于酵母细胞壁中，
9、占细胞壁的60%。目前，对啤酒废酵母的综合利用大多数集中在对其中的蛋白质、核酸、维生素、微量元素和酶方面，而对其细胞壁多糖的开发应用研究很少。0003 以啤酒废酵母为原料来制备细胞壁多糖的方法大体可归纳为：化学破壁（酸解、碱解）、物理破壁（液体剪切、固体剪切等）、生物破壁（酶解、自溶）。其中，化学破壁不仅会造成一些营养成分的破坏，而且增大了有效成分提取的难度；物理破壁虽然方法简单、成本低，能完整保留营养成分，但其破壁效果较差；而生物破壁中的酶解法会增加提取成本，故上述细胞壁多糖的制备方法均不便于工业上的广泛应用。自溶法是以存在酶活性的新鲜活酵母为原料，利用酵母细胞本身的酶系，在一定条件下，将酵
10、母体内的糖类物质、蛋白质和核酸分解为还原糖、氨基酸、肤类、核苷酸等小分子物质并从酵母细胞内提取出来的一种方法。自溶法工艺简便，应用广泛，生产成本低，对环境污染小，适合于工业化提取。0004 甘露寡糖（MOS，即Mannose-oligosaccharides）是甘露糖或甘露糖与葡萄糖通过-1,2、-1,3、-1,6或-1,3、-1,4糖苷键组成的寡聚糖，具有调节动物胃肠道微生态环境和动物机体免疫调节的功能。在食品、医药和动物饲料等方面具有重要的应用价值。由于酶解法反应条件温和及容易控制等优点，因此，采用甘露聚糖酶水解甘露聚糖制备甘露寡糖是生产甘露寡糖的主要方法。甘露聚糖酶的来源较广泛，包括细菌
11、、真菌、放线菌、植物以及软体动物等。其中，微生物来源的甘露聚糖酶具有pH最适点、温度范围和底物专一性等显著特点，其活性高、成本低、来源稳定、提取方便，且比动植物具有更广泛的应用，是产生甘露聚糖酶的主要来源。目前，细菌中的芽孢杆菌、假单胞菌、弧菌，真菌中的曲霉、木霉、酵母、青霉、多孔菌、核盘菌和放线菌中的链霉菌都是产生甘露聚糖酶的常见种类。根据其作用底物不同，甘露聚糖酶可分为-甘露聚糖酶和异甘露聚糖酶，其中，-甘露聚糖酶的作用底物为魔芋粉、槐豆胶等植物多糖，异甘露聚糖酶的作用底物为异甘露聚糖，这类异甘露聚糖主要存在于酵母等微生物的细胞壁中。目前，甘露寡糖主要是以-甘露聚糖酶水解魔芋粉、槐豆胶等植
12、物多糖制备而成，生产成本较高。而以异甘露聚糖为原料，采用异甘露聚糖酶水解法制备甘露寡糖并未见文献记载。说 明 书CN 102268468 ACN 102268475 A 2/5页5发明内容0005 针对现有的以-甘露聚糖酶水解植物多糖制备甘露聚糖，生产成本高的问题，本发明的目的是提供一种利用啤酒废酵母制得异甘露聚糖，并结合异甘露聚糖酶进行水解制备甘露寡糖的方法。0006 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种利用啤酒废酵母制备甘露寡糖的方法步骤如下：（1）由啤酒废酵母制得酵母细胞壁液体或固体；（2）制备异甘露聚糖酶粗酶液；（3）将经步骤（2）制得的异甘露聚糖酶粗酶液加入经步骤（1）制得的
13、 酵母细胞壁液体中水解制备甘露寡糖。0007 所述步骤（1）中制备酵母细胞壁固体的步骤如下：（a）啤酒废酵母预处理：将洗涤后的啤酒废酵母进行离心分离得到酵母泥；（b）制备酵母细胞壁液体：将质量浓度为50g/L150 g/L的酵母泥、质量浓度为400g/L500g/L的醋酸-醋酸钠缓冲液和蒸馏水混合，将制得的混合液置入密封容器中，搅匀后静止0.5h1h，并在温度30C80C下，水浴加热12h48h；酵母泥、醋酸-醋酸钠缓冲液和蒸馏水三种物料按1:3.5:4.5配比组成；（c）制备酵母细胞壁固体：将经步骤（b）制得的酵母细胞壁液体进行离心分离，弃上清液，将沉淀部分在温度40C80C下干燥12h48
14、h，制得酵母细胞壁固体。0008 所述步骤（b）中所述醋酸-醋酸钠缓冲液是将质量浓度分别为2.4g/L的醋酸、109.2g/的醋酸钠、20g/L的氯化钠和1L蒸馏水混合制得，所述醋酸-醋酸钠缓冲液的pH值为6。0009 所述步骤（2）中制备异甘露聚糖酶粗酶液的步骤如下：（a） 制备种子培养基溶液和发酵培养基溶液：按如下质量份的原料制备种子培养基溶液：酵母细胞壁 0.5g20g、蛋白胨 1g40g、氯化钠 0.5g20g、水1000 ml，种子培养基溶液pH值为5.08.0。0010 按如下质量份的原料制备发酵培养基溶液：酵母细胞壁 0.5g20g、蛋白胨 1g40g、氯化钠 0.5g20g、水
15、1000ml，发酵培养基溶液pH值为5.08.0。0011 （b）种子液的制备：将枯草芽孢杆菌菌株接种到经步骤（a）制得的种子培养基溶液中，在温度25C45C下培养12h72h，按质量浓度为10g/L200g/L的接种量接种到经步骤（a）制得的发酵培养基溶液培养，振荡器中温度为25C45C、振荡频率为100r/min250r/min，振荡培养时间为12h72h，制得发酵液。0012 （c）异甘露聚糖酶粗酶液的制备：对经步骤（b）制得的发酵液进行离心分离，取上清液制得异甘露聚糖酶粗酶液。0013 所述步骤（3）中甘露寡糖的制备步骤如下：取质量浓度为200g/L700g/L的异甘露聚糖酶粗酶液加入
16、质量浓度为10g/L200g/L的酵母细胞壁液体制得混合液，所述混合液pH值为58，水解温度为30 C80 C，水解时间为2h10h，水浴加热所述混合液至粘稠状，在30 C100 C下烘干至恒重，粉碎制得甘露寡糖粉末。说 明 书CN 102268468 ACN 102268475 A 3/5页60014 所述异甘露聚糖酶粗酶液和酵母细胞壁液体的混合液的pH值为58；所述混合液的水解温度为40-70C，水解时间为4-6 h。0015 在实际应用中种子液制备中采用的枯草芽孢杆菌菌株，也可以用安全性蜡样芽孢杆菌或其他分泌异甘露聚糖酶的安全微生物替代。0016 本专利的效果在于：利用啤酒废酵母自溶法来制备酵母细胞壁，在适宜条件下利用其自身的酶体系加水即可，减
