《第三章+3-1目的基因的获得》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第三章+3-1目的基因的获得（30页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第三章 目的基因的获得 目的基因的分离克隆和方法功能基因的4 个特性：1.基因有固定的一级结构2.每个基因在染色体上占有特定的位置3.每个基因有特定的转录模式4.大部分基因都有功能基因的分离与克隆方法：1.根据基因的功能蛋白分离目的基因2.根据mRNA特异性分离目的基因3.根据DNA的插入作用分离目的基因4.基因文库技术分离目的基因5.图位克隆分离目的基因6.酵母双杂交系统分离目的基因第三章 目的基因的获得一.根据基因的功能蛋白分离目的基因（一）技术路线（二）相关技术（三）基因分离蛋白质一级结构分析（AA序列测定）（一）技术路线分离纯化功能蛋白根据AA序列合成寡核苷酸片断PCR引物PCR扩增寡
2、核苷酸探针筛选基因文库DNA或cDNADNA或cDNA制备抗体筛选表达型基因文库（二）相关技术1.蛋白质分离纯化及双向电泳2.蛋白质氨基酸序列分析蛋白的分离纯化及双相电泳一. 分离纯化的一般程序样品的前处理：从组织或细胞中把蛋白溶解出来粗分级分离：与杂蛋白分离开细分级分离：进一步纯化二. 蛋白分离纯化的方法分离纯化蛋白的依据蛋白分子的大小溶解度电荷吸附性质对配体分子的生物学亲和力方法透析密度梯度离心凝胶过滤等电点沉淀蛋白的盐溶和盐析电泳离子交换层析吸附层析： 羟磷灰石（吸附剂）亲和层析：高压液相层析 凝集素亲和层析 免疫亲和层析 金属亲和层析1.盐析与有机溶剂沉淀：盐析：在蛋白溶液中加入大量中
3、性盐，以破坏蛋白的胶体性质，使蛋白从溶液中沉淀析出，称为盐析。常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。盐析时，溶液的pH在蛋白质的等电点处效果最好。盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白质的变性。分段盐析：半饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆球蛋白，而饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆清蛋白。有机溶剂沉淀蛋白质：凡能与水以任意比例混合的有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可用于沉淀蛋白质。沉淀原理：z 脱水作用；z 使水的介电常数降低，蛋白质溶解度降低。2. 透析法透析袋缓冲液SDS-PAGE电泳槽3. 等电聚焦电泳（IEF ）The Principle of Isoelectric Focusing.A pH gr
4、adient is established in a gel before loading the sample. (A) The sample is loaded and voltage is applied. The proteins will migrate to their isoelectric pH, the location at which they have no net charge. (B) The proteins form bands that can be excised and used for further experimentation. 双向电泳IEFSD
5、S-PAGE第三章 目的基因的获得（二）相关技术1.蛋白质分离纯化及双向电泳2.蛋白质氨基酸序列分析蛋白质氨基酸序列分析蛋白一级结构测定1953年英国剑桥大学Sanger F ，首次报道了牛胰岛素两条多肽链的aa序列。z胰岛素由A 、B 两条链组成，链之间有2 对二硫键，A链内有一对二硫键。目前，数万种蛋白序列已被完成，并且开始了蛋白组学研究。蛋白序列测定的策略一、多肽链数目的测定二、多肽链、或亚基的拆分三、肽链氨基酸组分测定四、多肽链的部分断裂和肽段的分离五、肽段氨基酸顺序测定六、肽段在多肽中次序的决定七、二硫键位置确定四、多肽链的部分断裂和肽段的分离Edman化学降解法只能连续降解几十个残
6、基；然而蛋白中却含有数百个残基，所以上述分离提纯的蛋白要用专一性强的蛋白水解酶或化学试剂进行有控制的裂解，形成一些小的片段，分别进行序列分析。1. 酶裂解法胰蛋白酶糜蛋白酶嗜热菌蛋白酶胃蛋白酶木瓜蛋白酶葡萄球菌蛋白酶和梭菌蛋白酶五、肽段氨基酸顺序测定1、Edman化学降解法2、酶解法3、质谱法4、根据核苷酸序列的推定法3、质谱法4、根据核苷酸序列的推定法六、肽段在多肽中次序的决定如果肽链只断裂成两段或三段，那么，根据每段 N端、或C- 端 aa的种类和序列，即可排出它的在原多肽链中的顺序。如果断裂成多条，即不能排序。必须有两种以上的方法断裂多肽，做成两套或几套肽段。这两套或几套肽段的切口彼此是
7、错位的。氨基酸序列分析例子一. 根据基因的功能蛋白分离目的基因（三）基因分离1.根据氨基酸序列设计简并性PCR 引物或寡聚核苷酸探针2. PCR扩增、克隆基因 模板 DNA cDNA 总RNA RT3.筛选基因文库 （C 库 G库）4.免疫学法筛选表达文库a，制备抗体b，构建表达文库c，筛选具有不同密码子的氨基酸密码数 氨基酸1Met Trp2 Phe Tyr His Gln Asn Lys Asp Glu Cys3 Ile4 Val Pro Thy Ala Gly5 Leu Ser Arg简并寡核苷酸探针库氨基酸序列： Val Asn Phe Tyr Ala Trp LysA T T T A AGTT AAC TTC TAC GCT TGG AAG寡核苷酸探针库： C GG C17核苷酸探针库（方框内，含32种序列）（2x2x2x4x1=32)利用抗体筛选表达文库（a）把原初平板上生长的嗜菌斑及其产生的融合蛋白质原位复印转移到硝酸纤维素滤膜上；（b）滤膜与第一抗体溶液一道温浴，漂洗后加放射性标记的第二抗体继续温浴；（c）放射自显影第四部分 目的基因的获得三.根据mRNA 的特异性分离目的基因(一）mRNA differential display PCR(DDRT PCR)
