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1、第七章 双水相萃取,2,3,主要内容,一、概述 二、物质在两相中的分配 三、双水相萃取工艺流程 四、双水相萃取技术的应用 五、思考题,4,一、概述,过滤和离心技术（取决于分离颗粒的尺寸或密度差异）难于进行收集微生物的细胞器、分离除去细胞碎片、提取和浓缩胞内物质的操作。 萃取已广泛用于液液分离，但一般的有机溶剂萃取难于分离蛋白质? （1）许多蛋白质有极强的亲水性，不溶于有机溶剂； （2）蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。 在一定条件下，水相也可形成两相甚至多相。将水溶性的酶、蛋白质等生物活性物质从一个水相转移到另一水相中成为可能。,5,1、最早的双水相萃取现象: 1896年Be jerinck，把
2、明胶与琼脂或把明胶和可溶性淀粉的水溶液混合，可分为两相，聚合物之间的“不相溶性”。,多种不相溶的聚合物可得到多相体系 原因？ 聚合物的空间阻碍作用，相互间无法渗透。,聚合物还可以与无机盐可形成聚合物-盐双水相。,6,2、优势,7,(1) 条件温和，保留产物活性 (2) 含水量高，表面张力低，耗能少 (3) 大分子及小分子（红霉素、氨基酸 等）都可萃取 (4) 易于放大,8,3、双水相体系形成,聚合物混合时，是分层或成一相，取决于分子间的作用力： 分子间作用力，与分子量有关，分子量越大，分间作用力也越大。 分子之间作用力： （1）A-A A-B 相分离 （2）A-AA-A 凝聚复合,9,4、双水
3、相体系类型,两种都是非离子型高聚物（PEG / DEX、聚丙二醇/ DEX等）(PEG：polyethylene glycol聚乙二醇 DEX:葡聚糖） 其中一种是离子型高聚物（羧甲基纤维素钠/葡聚糖DEX） 两种都是离子型高聚物（羧甲基纤维素钠/羧甲基葡聚糖钠） 其中一种是无机盐（磷酸盐、硫酸盐等）（ PEG /硫酸盐）,10,二、物质在两相中的分配,11,2、影响分配的因素,(1)双水相中聚合物（组成和浓度）的影响 分子量的影响 如在PEG/Dex双水相体系中，PEG分子量的减少，会使蛋白质在两相中的分配系数明显增大。,12,（2）体系中无机盐离子的影响 无机盐离子在两相中的分配不同，会导
4、致两上中的电位差。,13,如图，当pH6.9时，溶菌酶带正电，卵蛋白带负电，对照上表知，KCl-KNa+，有电位差，U2-U10，导致带正电荷的溶菌酶迁移到1相，其K值增大，而带负电荷的卵蛋白迁移到2相，其K值减少，两者达到较好的分离。,14,（3）体系pH值的影响 蛋白质的离解度改变蛋白质的电荷改变分配系数。 缓冲物质磷酸盐的离解度改变电位差分配系数。 pH的微小变化会使蛋白质的分配系数改变2-3个数量级。,15,（4）体系温度的影响 温度的变化分配率蛋白质的生物活性。 聚合物的多元醇或多糖结构对蛋白质有 保护作用，增加了蛋白质的稳定性，故可 在室温一操作，且一般温度变化不大。,16,（5）
5、体系中微生物的影响 影响：上下相体积、胞内蛋白的分配系数。,17,三、双水相萃取工艺流程,18,1、双水相系统的选择,相系统应易于用静置沉降或离心沉降法进行分离。 对胞内蛋白萃取，使碎片分配于下相中，来增大两相的密度差，达到快速分离，降低操作成本和操作时间。 根据目标蛋白质和共存杂质的表面疏水性、相对分子质量、等电点和表面电荷等性质的差别，来选择萃取目标产物。如调pH、添加盐、提高成相系统的浓度（系线长度）,19,双水相萃取过程放大较容易，一般10mL刻度离心管内结果即可直接放大到产业化规模。具体的实验步骤： 配制一系列不同浓度、pH值及离子强度的双水相，每个双水相改变一个参数。 加入料液后，
6、再加水使整个系统的质量达到5-10g。离心管封口后充分混合。（反复倒置或涡旋混合器） 在1800-2000g下离心3-5min，分相。 分别吸出上下相，测定上、下相中目标产物的浓度或生物活性，计算分配系数。 分析目标产物的收率和纯化倍数，确定最佳双水相系统。,20,2、相平衡与相分离,相平衡：双水相系统的表面张力很小，相间混合所需能量很低，通过机械搅拌很容易分散成微小液滴，达到相平衡所需时间很短，一般只需几秒钟。 相分离：重力沉降（静置分层）或离心沉降法。,21,3、多步萃取,22,4、大规模双水相萃取,双水相放大后，溶质的分配系数和相体积比保持不变，溶质的浓度随匀浆液的加入量线性增大。,23
7、,四、双水相萃取技术的应用,目前广泛应用于蛋白质的分离与纯化。 1、胞内酶提取： 一般是破碎细胞（匀浆液粘度大，碎片很小） 离心分离（能耗大，且碎片不易清除干净） 双水相萃取（易除去碎片，同时使酶得到精制） 目前应用最多的是PEG/盐体系。 酶主要分配在上相，碎片在下相或界面上，收率 能达到90%；料液中湿细胞浓度可达30%，分配系 数在3-20之间。如下表,24,25,例子：以甲酸脱氢酶（FDH）的分步提取纯化来进一步说明胞内酶的提取。,26,27,2、核酸的分离及纯化,特点：盐组成的微小变化引起分配系数的急剧变动。 有活性的DNA与无活性的DNA的分配系数差别较大。 可通过多级逆流分配平衡
8、将两者几乎完全分开。,28,3、人生长激素、-干扰素的提取 用PEG4000 6.6%/磷酸盐14%体系从大肠杆菌提取。 4、病毒的提取、纯化 5、生物活性物质的分析检测,29,何谓双水相萃取？ 在一定条件下，水相可形以成两相。将水溶性的酶、蛋白质等生物活性物质从一个水相转移到另一水相的过程。,30,双水相体系可分为那几类？目前常用的体系有那 两种？ 两种都是非离子型高聚物（PEG / DEX、聚丙二醇/ DEX等） 其中一种是离子型高聚物（羧甲基纤维素钠/葡聚糖DEX） 两种都是离子型高聚物（羧甲基纤维素钠/羧甲基葡聚糖钠） 其中一种是无机盐（磷酸盐、硫酸盐等）（ PEG /硫酸盐）,31,
9、双水相萃取的优点？ (1) 条件温和，保留产物活性 (2) 含水量高，表面张力低，耗能少 (3) 大分子及小分子都可萃取 (4) 易于放大,32,为什么说蛋白质等生物活性大分子物质不适合 用有机溶剂萃取分离而适合用双水相萃取分 离？ （1）许多蛋白质有极强的亲水性，不溶 于有机溶剂。 （2）蛋白质在有机溶剂相中易变性失 活。,33,影响双水相萃取的因素有那些？ （1）双水相中聚合物（组成和浓度）的影 （2）体系中无机盐离子的影响 （3）体系pH值的影响 （4）体系温度的影响 （5）体系中微生物的影响,34,用双水相萃取细胞破碎（匀浆）液时，一般是把目标产物分布在上相，而细胞碎片、杂蛋白等杂质分
10、布在下相，为什么？ （1）核酸等大部分杂质一般处于下相，可以同时除去。 （2）下相一般是无机盐富集相，作为废弃物扔掉，费用相应低一些。 （3）将蛋白质产物分配在上相有利于保持其活性。 （4）碎片在下相有利于连续离心分离。,35,选择双水相系统的原则？ 相系统应易于用静置沉降或离心沉降法进行分离。 对胞内蛋白萃取，使碎片分配于下相中，来增大两相的密度差，达到快速分离，降低操作成本和操作时间。 根据目标蛋白质和共存杂质的表面疏水性、相对分子质量、等电点和表面电荷等性质的差别，来选择萃取目标产物。如调pH、添加盐、提高成相系统的浓度（系线长度）,36,双水相系统的相平衡需要很长时间吗？ 不需要。双水相系统的表面张力很小，相间混合所需能量很低，通过机械搅拌很容易分散成微小液滴，达到相平衡所需时间很短，一般只需几秒钟。,37,双水相萃取技术应用在那些方面？ 1、胞内酶提取 2、核酸的分离及纯化 3、人生长激素、-干扰素的提取 4、病毒的提取、纯化 5、生物活性物质的分析检测,
