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1、实 验 一 细菌的简单染色和革兰氏染色,辽宁师范大学生物基础实验教学中心 谢鲲鹏,（一）实验目的：,1、学习微生物涂片的基本技术 2、巩固显微镜的使用方法和无菌操作技术 3、掌握细菌的简单染色法和革兰氏染色法。,（二）实验原理：,1、简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的方法。此法操作简便，适用菌体一般形态和细菌排列的观察。 2、革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram氏创立的。而后一些学者在此基础上作了某些改进。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。,（三）实验器材,1、菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。 2、染色剂：吕氏美蓝、结晶紫、碘液、 95%酒精、番红。 3、仪器或其他
2、用具：显微镜、酒精灯、 载玻片、接种杯、双层瓶、擦镜纸、 吸水纸、废液缸、洗瓶等。,（四）实验方法：,1、简单染色： （1）涂片：取两块载玻片，各滴一小滴生理盐水于玻片中央， 用接种环以无菌操作分别从大肠杆菌和金黄色葡萄球菌 斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。 （2）干燥：室温自然干燥。 （3）固定：涂面朝上，通过火焰2-3次。 （4）染色：将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液于涂片上。 （5）水洗：倒去染液，用自来水冲洗，直至涂片上流下的水 无色为止。 （6）干燥：自然干燥，或用电吹风吹干，也可以用吸水纸吸干。 （7）镜检：涂片干后镜检。,2、革兰氏染色： （1）制片：取菌种培养物常规
3、涂片，干燥，固定。 （2）初染：滴加结晶紫染色1min，水洗。 （3）媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min， 水洗。 （4）脱色：用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜， 在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直 至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。 （5）复染：用番红复染约2min，水洗。 （6）镜检：干燥后用油镜观察。 （7）混合涂片染色,（五）实验总结,1、实验结果,简单染色,革兰氏染色,2、复习 （1）简单染色操作步骤 涂片干燥固定吕氏美蓝染色1-2分钟水洗 干燥镜检 （2）革兰氏染色操作步骤 制片初染（结晶紫）1min水洗媒染（碘液）1min水洗脱色（95%乙醇至无色）20-30
4、S水洗复染（番红）2min水洗干燥镜检,3、注意事项 （1）涂片不宜过厚，以免脱色不完全，造成假阳性。 （2）乙醇脱色时间，如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。 （3）菌龄，应选择活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色。培养时间过长，或死亡及部分自溶，改变了细菌CW的通透性，造成阳性菌的假阴性反应。 （4）火焰固定不宜过热。 （5）媒染剂的作用，是增加染料和细胞之间的亲和性或吸附力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使之不易脱落。,4、思考题 （1）你认为制备细菌染色标本时，尤其应该注意那些环节？ （2）如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题？如果 加热温度过高，时间太长，又会怎么样呢？ （3）你认为那些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其 中最关键的环节是什么？ （4）革兰氏染色时，初染前能加碘液吗？乙醇脱色后复染 之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色？,
