《组织细胞原位凋亡实验》由会员分享，可在线阅读，更多相关《组织细胞原位凋亡实验（4页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 TUNEL 法测凋亡操作步骤一、TUNEL检测原理 TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒是采用非同位素方法来检测细胞在凋亡过程中DNA 的断裂情况，可在原位快速准确地检测单个凋亡细胞。本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）的凋亡原位检测。 其原理是细胞凋亡发生时，内源性核酸酶激活，使DNA的双链断裂或一条链出现缺口，产生一系列3-OH末端，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）作用下，组织细胞原位DNA切口可被标记上生物素-dUTP，即TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End L
2、abeling），可与连接了的辣根过氧化酶的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）特异结合，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB）的存在下，显示为棕色（过氧化物酶活性），特异准确地定位正在凋亡的细胞，在普通显微镜下即可观察和计数凋亡细胞；由于正的或正在增殖的细胞几乎没有DNA 的断裂，因而没有3-OH 形成，很少能够被染色。二、试剂盒组份 组 份 10 assays 25 assays 储存条件A：Equilibration Buffer 1.0 mL 2.5 mL -20 B：Biotinylated Nucleotide Mix 10 L 25 L -20 C：TdT Enzym
3、e 10 L 25 L -20 D：500Proteinase K 10 L 25 L -20 20SSC 15 mL 38 mL 4 E：Streptavidin-HRP 10 L 25 L 4 F：20DAB Substrate Buffer 50 L 125 L 4 G：20DAB Chromogen 50 L 125 L 4 H：20Hydrogen Peroxide 50 L 125 L 4 三、操作流程1.操作流程概览2.细胞样本制备准备： PBS：8.0g NaCl， 0.2 g KCl， 1.44g Na2HPO4，0.24g KH2PO4，溶于800ml去离子水中，HCl调p
4、H至7.4，加水定容至1L。 固定液：4%多聚甲醛溶于pH7.4的PBS中，新鲜配制； 封闭液：3%H2O2溶于甲醇； 细胞膜通透液：0.1%TritonX-100溶于PBS，新鲜配制；操作步骤：1)经过实验处理的细胞爬片或细胞涂片，自然晾干；2)室温固定15min30min；PBS漂洗35min；3)浸入封闭液中，室温封闭10min；PBS漂洗35min；4)浸入细胞膜通透液中，室温30sec2min；5)进行标记反应。3.石蜡包埋组织切片预处理准备： 石蜡切片脱蜡至水：二甲苯脱蜡210min，梯度乙醇水合（100%、95%、90%、80%、70%）； 蛋白酶K工作液：2 L500蛋白酶K
5、+ 998 L PBS； 固定液：4%多聚甲醛溶于pH7.4的PBS中，新鲜配制； 封闭液：3%H2O2溶于甲醇。操作步骤：1)石蜡包埋的组织切片按常规方法脱蜡至水；2)PBS漂洗35min；3)加入蛋白酶K工作液，37反应1530min；PBS漂洗35min；4)（选择进行）室温固定15min30min；PBS漂洗35min；5)浸入封闭液中，室温封闭10min，PBS漂洗35min；6)进行标记反应。4.冰冻组织切片预处理准备： 固定液：4%多聚甲醛溶于pH7.4的PBS中，新鲜配制； 封闭液：3%H2O2溶于甲醇； 细胞膜通透液：0.1%TritonX-100溶于PBS，新鲜配制；操作步
6、骤：1)冰冻切片浸入固定液，室温固定10min；PBS漂洗35min；2)浸入封闭液中，室温封闭10min；PBS漂洗35min；3)浸入通透液中，室温30sec2min；4)进行标记反应。5.阳性对照和阴性对照的准备TUNEL检测时需要设立阳性对照和阴性对照，以显示实验的客观性和准确性。1)阳性对照样本的处理（选择进行） DNaseI反应液（用户自备）： （10U-3000U DNase I；40mM Tris-HCl pH 7.9； 10 mM NaCl；6mM MgCl2；10mM CaCl2）组织样本经过蛋白酶K处理或者通透液处理，PBS浸洗后，加入100 L DNaseI反应液，室温
7、孵育1030min，用去离子水彻底清洗玻片，浸入PBS漂洗5min，进行标记反应。2)阴性对照样本的处理 在进行标记反应过程配制TdT酶反应液时，不加入TdT酶，其余步骤相同。四、标记和显色反应以下操作在湿盒内进行。1.预处理好的样本经过PBS漂洗后，用滤纸轻轻吸去样本周围液体；2.每个样本滴加100 L TdT酶反应液，于37#61616;C避光反应60min；TdT酶反应液的准备（即用即配）： 成分 标准100 L/片 切片数 总体积 Equilibration Buffer 98 L = Biotinylated Nucleotide Mix 1 L = TdT Enzyme 1 L =
8、阴性对照片不加TdT酶。3.用去离子水按1：10稀释20SSC，进行终止反应，室温15min；然后PBS漂洗35min；4.浸入0.3%H2O2/PBS中封闭内源性过氧化物酶活性，室温孵育35min；PBS漂洗35min；5.滴加100 L Streptavidin-HRP工作液（按1：500稀释为工作液），于37反应3060min；6.PBS漂洗35min；7.滴加DAB显色液： 成分 100 L/片 切片数 总体积 20DAB Substrate Buffer 5 = 20DAB Chromogen 5 = 20Hydrogen Peroxide 5 = ddH2O 85 =8.用去离子水漂洗数次；（选择进行复染细胞核）；9.中性树胶封片，显微镜下观察。注意事项：1.PBS清洗后，请尽量去除PBS液体再进行下一步反应；2.避免载波片上的样本干燥造成实验失败；3.TdT酶反应液应即用即配，在冰上进行，不宜长期保存；4.复染细胞核可以用甲基绿染液（用户自备）。参照图
