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1、2003中标申请代码：C03020303：题目：一个新的调控肿瘤血管生成的候选分子Rac1及其作用机制的研究项目的立项依据（附主要的参考文献目录）研究意义：血管生成是肿瘤生长、侵袭、转移和复发的基础，肿瘤血管生成是一个非常复杂的过程，受多种分子的调节，尽管目前在肿瘤血管生成方面的研究取得了很大的突破，但仍存在不足之处。首先，诸多血管生成调节因子的上游调控机制并未完全阐明；其次，内皮细胞和肿瘤细胞分别通过自分泌和旁分泌途径来调节血管生成，哪些分子能同时调节并协调这两条途径呢？我们的工作基础和文献研究表明Rac1可能正是解决这两方面不足的关键分子。Rac1属于Rho GTPases家族，在肿瘤的发
2、生、侵袭和转移、细胞周期调控及凋亡过程中发挥着重要作用。一方面，我们的研究表明，在缺氧情况下，多种肿瘤细胞中Rac1mRNA和活性水平较正常明显增高，4h达到高峰，可持续至16 h后表达水平逐渐降低，且其活性高低与HIF-1、VEGF、p53表达水平呈正相关；而应用负显性的Rac1可显著减弱VEGF的表达。由于VEGF是参与肿瘤血管生成的一个主要分子，这就提示我们，抑制Rac1可能直接抑制肿瘤血管生成。另有其它研究也同样表明Rac1参与缺氧情况下HIF-1（缺氧诱导因子1）的活化，促进HIF-1的转录活性和蛋白表达。HIF-1是肿瘤生长过程中的一个重要调节因子，活化的HIF-1可促进许多与血管
3、生成相关的基因的转录，如VEGF、VEGFR、FGF、TGF、Cox2和NOS，从而维持肿瘤细胞能量代谢，促进肿瘤的增殖和转移。另一方面，Rac1可调节ECM（细胞外基质）和VEGF（血管内皮细胞生长因子）诱导的内皮细胞的趋触和趋化作用，促进内皮细胞的增殖、运动和迁移，是VEGFR(VEGF受体)后信号通路的一个重要中间分子。此外，许多药物及分子，如磷酸鞘氨醇、组织因子、非甾体类抗炎药、斯伐他仃和活性氧簇等都通过 Rac1调节内皮细胞运动。因此，Rac1可能是血管生成过程中的一个关键调控因子。为证明这一设想，本研究拟利用RNAi和蛋白质双向电泳技术探讨Rac1对肿瘤血管生成的调控作用及可能的调
4、控机制，为进一步阐明Rac1的生理病理作用、深入理解肿瘤血管生成的机制及开发新型的血管生成抑制剂奠定一定的理论基础。国内外研究现状及分析1血管生成是肿瘤生长、侵袭转移和复发的基础肿瘤血管生成是肿瘤迅速增殖的前提条件1。原位肿瘤细胞在肿瘤发生的初期通过组织间液获取从毛细血管渗透的营养物质，排泄代谢产物，并进行氧气交换。由于细胞增殖缓慢且数目有限，局部组织间液足以支持肿瘤细胞的生长，这种状态可维持相当长的时间，称为血管前期。在无自身血供的条件下，肿瘤的体积几乎不超过12mm3。随着肿瘤细胞的不断增殖，仅通过渗透过程已不能满足细胞生长的需要，瘤体组织的微环境出现缺氧、代谢产物堆积、PH值改变等。这些
5、因素刺激肿瘤细胞、周围的间质细胞和淋巴细胞分泌血管生长刺激因子，同时抑制血管生长抑制因子产生，打破二者在肿瘤组织局部的平衡，诱导血管基底膜降解和内皮细胞增殖，启动血管生成2。肿瘤血管内皮细胞的分裂速度比正常血管内皮细胞快得多，所生成的血管生长因子也可通过自分泌和旁分泌形式参与血管生成的调节。 肿瘤侵袭转移在两个阶段依赖血管生成：第一，在原发肿瘤出现新生血管之前，肿瘤细胞一般不会从原发灶脱落，而原发肿瘤的血管组织越丰富，肿瘤细胞转移的机会就越大。新生的肿瘤血管基底膜和细胞连接较少，血管通透性高，是肿瘤细胞转移的门户和路径。第二，转移的瘤细胞在到达目的器官后必须重新经历新血管生成过程，否则转移的细
6、胞只能在它们渗出循环的微血管周围形成显微水平的血管前期袖状结构3-4。 肿瘤血管生成还与肿瘤的预后密切相关，通过组织形态学、免疫组化、生物化学和影像学等测定肿瘤组织的血管密度和血管生长因子水平及血清中血管生长因子水平可知，血管生成是多种肿瘤复发、转移和预后的判断标准5，例如浸润性乳腺管癌、早期胃癌、肺腺癌等。2肿瘤血管生成是诸多因素共同作用的结果血管生成是多因素作用的结果，其中血管生长刺激因子和血管生长抑制因子直接地影响血管内皮细胞和基质细胞，二者之间的平衡决定了促进或阻止血管生成。微环境的供血不足会造成局部组织缺氧，从而诱导血管内皮细胞、基质细胞、肿瘤细胞生成血管生长刺激因子和抑制因子，通过
7、自分泌或旁分泌的形式发挥作用，并且某些因子还可进入血液循环，作用于远端组织。血管生长刺激因子不仅能够刺激血管内皮细胞增殖、迁移、基质蛋白裂解和形成毛细血管结构，而且也可作用于血管周围基质细胞和血管壁的平滑肌细胞，诱导其增殖和分泌等。目前已确定出十几种血管生长刺激因子，包括VEGF家族、EGF/TGF-、FGF家族、TNF-、IL-8、血管生成素angiogenin等。在正常生理条件下，血管生长抑制因子可维持血管内皮细胞的相对静止状态，防止血管过度增生，与血管生长刺激因子一起构成复杂而精确的调节网络。血管生长抑制因子参与血管生成的各个步骤，既可直接抑制血管内皮细胞的增殖和迁移，阻碍胞外基质降解，
8、也可通过抑制刺激因子的表达，拮抗其功能，间接抑制血管生成。如肿瘤细胞、肿瘤浸润细胞（单核细胞、巨噬细胞）、肿瘤血管内皮细胞和基质细胞等分泌的血管生长因子通过自分泌或旁分泌等途径发挥作用。激活的单核细胞/巨噬细胞分泌TNF-和IL-1，刺激黑色素瘤细胞分泌IL-8和VEGF，都可促进肿瘤血管生成。表1 血管生长调节因子 除了血管生长因子及抑制因子外，肿瘤血管生成血管生长刺激因子血管生长抑制因子VEGFEndostatinbFGF aFGFAngostatinTGF- EGFIL-1G-CSFIL-12HGFIP-10IL-8SDF-1Platelet-activating factorTSP-1
9、PLGFIFN,ProliferinTIMPs 1,2,3,4PDEGF/Thymidine porylasePF4B6116K prolactin fragmentE-selectinProliferin related proteinAngiogeninProfactin fragmentAngiotropinProtamineAngiopoetinTGFTNFTNFTGFTGFThrombospondinSubstance PMinocyclineProstaglandin E1/E22-methoxycestrandolFAS ligandPetinoic acid还受癌基因、化合物、
10、激素和酶等多种因素的影响。肿瘤相关基因表达异常能够导致旁分泌的血管生长因子水平改变，如ras突变可明显诱导VEGF的表达；在慢性胰腺炎和胰腺癌中，K-ras基因突变与血管生成的增加密切相关，可能促进肿瘤血管生成6。癌基因c-met参与多种肿瘤的发生和发展，与肿瘤的预后密切相关，其基因产物是血管刺激因子HGF的受体，作为一种跨膜酪氨酸激酶，参与肿瘤血管生长调节7。肿瘤细胞中p53突变或缺失则导致HIF-1增加和VEGF转录增强，间接刺激肿瘤血管生成8。此外，多种化合物和激素，如TNP-470烟曲霉素类似物、NAC、一些类固醇类激素可抑制血管内皮细胞的运动和血管生成；而金属蛋白酶（MMPs）还可通
11、过降解基质促进肿瘤的血管生成和细胞转移。3 目前在肿瘤血管生成研究方面存在的不足之处尽管目前在肿瘤血管生成方面的研究取得了很大的突破，但仍存在不足之处。首先，目前一些针对上述单个因子或多个因子的治疗并未取得较佳的疗效，是什么原因呢？我们知道，肿瘤的发生是一个多基因参与的复杂过程，与正常细胞相比，肿瘤细胞的表达谱紊乱，表现为多种分子表达失调。同样，在肿瘤的血管生成过程中，单分子的作用是非常微弱的，只有多种分子共同作用才能最终导致血管生成。那么，这诸多分子的上游机制是什么？有没有一个能调控多种肿瘤血管生成相关因素的分子？如果能找到一个能有效调节并协调多种因素的分子，也许将为肿瘤血管生成的相关研究开
12、辟新的领域。其次，目前有关肿瘤血管生成方面的研究或者针对肿瘤细胞，或者针对内皮细胞，而未将两者有机地结合起来。肿瘤细胞和内皮细胞可通过旁分泌和自分泌两条途径共同促进肿瘤血管生成，有无关键性的分子可同时调节这两条途径呢？这些问题都有待进一步的研究来解答。目前的文献和我们的工作基础表明Rac1可能正是解决这两方面不足的关键分子。4 Rac1可能是调控肿瘤血管生成的核心分子41 Rac1与肿瘤Rac1全称为Ras相关的C3肉毒毒素底物1（ras-related C3 botulinum toxin substrate 1），属于Rho-GTP酶家族。 Rho-GTP酶是小GTPases家族的成员之一
13、，是一组分子质量约2025kDa的单体鸟苷酸结合蛋白，其活性受GDP/GTP循环调节。Rho蛋白与GDP结合时处于非活性状态，在鸟苷酸交换因子（guanine nucleotide exchange factor，GEF）或GDP解离刺激因子（GDP dissociation stimulator，GDS）作用下释放GDP，遂结合GTP成为活性蛋白。活化的Rho蛋白作用于胞浆中多种信号分子，调节细胞内信号的传递。同时，Rho蛋白的GTP酶活性可以将GTP转变为GDP，继使Rho蛋白灭活。GTP酶激活蛋白（GAP）可以诱导Rho蛋白的GTP酶活性，促进Rho蛋白的灭活。另外GDP解离抑制剂（GD
14、P dissociation inhibitor，GDI）可将胞浆内GDP结合形式的Rho蛋白从GTP-GDP循环中分离出来，从而抑制Rho蛋白的活性。 Rac1基因全长29kb，定位于7p22，与人类Rho及Ras基因具有58%及30%的氨基酸同源性。Rac1位于细胞膜内，广泛表达于多种组织，尤以心脏、肾脏及胰腺表达水平高，是一典型的看家基因9。目前的研究表明，Rac1在肿瘤发生、侵袭和转移、细胞周期调控及凋亡过程中发挥着重要的作用。Rac1参与Ras对纤维母细胞的转化能力10，其功能失调可促进侵袭性肿瘤中上皮向间质的转换，并导致细胞粘附连接功能的丧失11。Rac1还可通过调节细胞外基质蛋白
15、、基质金属蛋白酶(MMPs)或其拮抗剂(TIMPs)的水平来调节ECM的降解和重组12，从而促进肿瘤的侵袭和转移。此外，Rac1还通过上调CyclinD1和释放活性氧参与细胞周期的调控和凋亡过程。Rac1b是Rac1的变异剪接体，主要在肠道上皮组织和皮肤表达，在不同进展阶段的结直肠癌中，Rac1b表达水平明显上升，提示Rac1b参与肠道上皮正常和恶性生长13。另有研究者在乳腺癌组织中也鉴定出了Rac1b，认为Rac1b是作为一种快速循环的GTP酶来发挥作用的14。目前关于Rac1b和肿瘤的研究非常少，仅明确其可能参与乳腺癌和结直肠癌的发生、发展。由于Rac1b主要是作为一种快速循环的GTP酶来发挥作用，而目前国际上认为这种形式可能比活性形式更有效，因此，对于Rac1b与肿瘤的研究可能具有很好的前景。42 Rac1参与肿瘤血管生成在血管生成中，内皮细胞在趋化因子的作用下开始运动，因此明确内皮细胞的运动机制对控制血管生成及预防肿瘤非
