《基于高通量测序转录组学研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基于高通量测序转录组学研究（59页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、Web: | Tel:400-600-9335 易 康 2016 年 3 月 基于新一代高通量测序的 转录组学研究 Web: | Tel:400-600-9335 2 多组学研究 Web: | Tel:400-600-9335 RNA: Aridge connect genotype to phenotype GenomeGenotype Epigenetics mRNA Metabolome Phenotype ncRNA Protein Trans-omics Intermediate phenotype 3 Web: | Tel:400-600-9335 RNASeq: Charact
2、erize the transcriptome in unparalleled detail mRNA Expression level eQTL analysis Alternative splicing SNP RNA editting Small RNA Expression level SNP Novel small RNA Long ncRNA Expression level Structure SNP Novel ncRNA Gene fusion Novel mRNA Transcriptome assembly Interaction: HITS- CLIP, Degrado
3、me Web: | Tel:400-600-9335 5 Web: | Tel:400-600-9335 mRNA 常规建库 Web: | Tel:400-600-9335 非常规转录组建库 链特异性文库 均一化文库 Non-Coding转录组文库 特殊插入片段文库 FFPE样品文库 Low input RNA-Seq 单细胞转录组 移植瘤 。 Web: | Tel:400-600-9335 转录组分析内容 原始下机序列 数据质控 不参考序列比对 过滤 转录本拼接 有参转录组无参转录组 预测新转录本 可变剪切分析 组装结果分析评估 蛋白质互作网络分析 Unigene功能注释 基因表达水平分析
4、差异表达基因分析 GO/KEGG富集分析 预测编码蛋白框 SNP/SSR分析SNP分析 Total RNA mRNA文库 Illumina HiSeq测序 Web: | Tel:400-600-9335 不同策略： 定量分析定量分析 酶切标签法随机测序 Web: | Tel:400-600-9335 差异基因表达分析 DESeq2 有生物学重复的差异基因标准： |log2Ratio|1 ，q- value200nt 22nt21-28nt2631nt Non-coding RNAs Classification Web: | Tel:400-600-9335 小RNA是一大类具有调控基因表达作
5、用的非编码小 分子RNA，其长度一般在1830nt左右 小干扰 RNA(siRNA) microRNA(miRNA) piRNA 重复相关小 RNA (repeat associated RNA) 核仁小 RNA(snoRNA) 小核 RNA(snRNA) 小胞浆 RNA(scRNA) Small RNA 35 Web: | Tel:400-600-9335 miRNA 功能 完美的结合，完美的结合， 降解降解mRNA， 多见于植物多见于植物 不完全的结合，不完全的结合， UTR区域，干扰区域，干扰 mRNA表达，多表达，多 见于动物见于动物 36 Web: | Tel:400-600-933
6、5 小RNA研究案例 研究材料： 鉴定秦川牛背最长肌的miRNA，胚胎期和成年牛的背最长肌RNA，提取小 RNA，迚行测序 测序策略： miRNA测序 研究成果： 鉴定出417个已知的miRNA和104个新的RNA； 丌同组织及丌同胚胎时期的miRNA表达水平丌同，表明小RNA影响了牛的肌 肉组织细胞的生长。 Web: | Tel:400-600-9335 小RNA研究案例 小RNA的长度分布成年牛和牛的胎儿中丌同的miRNA表达水平 通过RT-QPCR鉴定不肌肉相关的丌同组织中牛mi-RNA的表达水平 Web: | Tel:400-600-9335 Web: | Tel:400-600-93
7、35 与转录因子结合， 调控靶基因 与microRNA效应复合 物结合，导致其失去调 节功能 与调节蛋白结合 招募靶标染色质 修饰物 参与靶mRNA调节与加工 翻译抑制、剪切拼接、 降解等 LncRNA生物学功能 40 Web: | Tel:400-600-9335 Classes of lncRNA lincRNA=Long intergenic RNA lncRNA=Long noncoding RNA ncRNA=Noncoding RNA lincRNA lncRNA ncRNA lncRNAs are often defined by their location relative
8、to nearby protein-coding genes. Web: | Tel:400-600-9335 2016-3-22 coding TCGA(LUAD cohort); Korean population (Seo cohort). 研究结果： 通过严格过滤方法得到3452个未被注释过的位于基因间区域的新的lncRNA； 通过tumor/control比较，发现111个差异表达lncRNA,称为肺癌相关 lncRNAs (LCALs) lung cancer-associated lncRNAs； pan-cancer分析另外324对癌症/癌旁数据，发现一个在肺癌中特异富集表达的
9、 lncRNA集合； 整合外显子测序数据发现LCALs和肺癌的关键原癌基因突变状态显著相关； 功能验证，基因敲除和过表达，表明最大差异表达的lncRNA,LCAL1在细胞 增殖中起作用。 Web: | Tel:400-600-9335 lncRNA研究案例 新的lncRNA的预测流程 新的lncRNA的蛋白编码潜力预测 新的lncRNA相对于蛋白 编码基因mRNA具有较 低的蛋白编码潜力和 ORF长度，但是和已知 的non-codingRNA和 lncRNA具有相似的特征 活性启动子相关的 H3K4me3组蛋白修饰 ChIPseq实验证实新的 lncRNA是独立存在的， 而丌是临近的编码基因
10、的延伸 新的lncRNA的整体长度短于mRNA,预测由于 lncRNA偏向具有较少的外显子数量 Web: | Tel:400-600-9335 lncRNA研究案例 在3个cohort中，具有致癌 功能的lncRNA的表达情况 在每个cohort中tumor/control 中111个LCALs的表达情况 肺癌外显子芯片验证变化 的肺癌lncRNA Web: | Tel:400-600-9335 lncRNA研究案例 LCAL1,5,7的结构特征，reads覆盖度 和QPCR验证表达水平 Pan-cancer分析其他7种实体肿瘤 (327对癌/癌旁)111个LCAL的表达情况 LCAL热图表明
11、绝大 部分的LCAL是肺癌 特异性的，可以做为 潜在的biomarker 6个以前未研究但经本次实 验验证的lncRNA在丌同肿 瘤中的表达水平和变化数 Web: | Tel:400-600-9335 lncRNA研究案例 LCALs和肺癌的关键原癌基因突变状态的相关性LCAL1的表达影响细胞生长 LCAL1的 siRNA干扰敲除 和过表达实验， 及QPCR验证证 实其表达影响 细胞生长 在 LUAD, TP53和KEAP1 的突变状态分别 不19个 和8个 LCALs显著相关。在LUSC, NFE2L2 突变状态不6个LCALs显著相关 Web: | Tel:400-600-9335 环状R
12、NA Circular RNAs are alarge class of animal RNAs with regulatory potency.Nature 一种人类环状RNA，不小脑变性相关蛋白-1的转录物呈反义，它含有 67个可以不古老的微RNA miR-7结合的位点。 环状RNA的特异的剪接方式 环状RNA对miRNA的海绵效应模型 环状RNA大量存在 Web: | Tel:400-600-9335 51 Web: | Tel:400-600-9335 LncRNA功能验证 体外实验 功能验证 构建动物模型 导入过表达载体，siRNA 检测动物表型变化及生化指标和相关基因表达 体内 实
13、验验证 lncRNA检测验证：qPCR、FISH 功能获得性研究：过表达载体 功能缺失性研究：siRNA、shRNA Web: | Tel:400-600-9335 mRNA与ncRNA测序关联分析 case mRNA和和ncRNA 建库测序建库测序 数据质控，分析数据质控，分析 差异表达差异表达 ncRNA筛选筛选 差异表达差异表达 mRNA筛选筛选 新新ncRNA功能预测功能预测 ncRNA-靶基因靶基因 关系分析关系分析 ncRNA和和mRNA联联 合分析合分析 染色质重塑染色质重塑转录调控转录调控ceRNA调控机制调控机制 control mRNA不ncRNA测序关联分析技术路线图 W
14、eb: | Tel:400-600-9335 实验材料：小鼠的晶状体 取样时期：胚胎（E15、E18），产后（ P0, P3, P6和 P9 ）共6个时期 研究策略：转录组测序、microRNA测序 分析内容：PCA主成分分析、时间迚程表达量分析 小鼠晶状体转录组研究 Web: | Tel:400-600-9335 图 mRNA和miRNA表达量时 间迚程分析 实验结果 ： 通过数据分析6个时期共获得了 14,465 个表达基因。 不E15期相比，在后期发育中，有 46个基因表现出了40倍戒更高的表达 变化量。 共发现了379 个miRNAs，其中49 个 miRNAs 在发育后期表现出了不 E15期相比八倍戒更高的表达变化量。 Web: | Tel:400-600-9335 转录组研究案例转录组研究案例 研究内容：研究内容： solitary fibrous tumor (SFT)/hemangiopericytoma 血管外皮细胞瘤 测序方法：测序方法： 外显子测序结合转录组测序，Illumina HiSeq 2000，100PE 研究结果：研究结果： 发现转录组抑制子NAB2和转录组激活子STAT6两个基因的基因融合 NAB2-STAT6现象； 在27个其他SFT病人中转录组测序都发现了NAB2-STAT6基因融合； 在51个
