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1、PCR检测外源基因的整合 RT-PCR检测外源基因的表达,PCR检测外源基因的整合,(1)PCR的基本原理 (2)检测外源基因的整合 (3)PCR检测的优缺点,PCR的基本原理,聚合酶链式反应简称PCR(英文全称:Polymerase Chain Reaction) 其基本原理是:DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链,在DNA聚合酶与启动子的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。 实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,并设计引物做启动子,加入DN
2、A聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制 。,检测外源基因的整合,在转基因个体的检测中,通过设计外源基因两端的特异引物,采用PCR技术就可以使外源基因片段得以大量的扩增,然后通过琼脂糖凝胶电泳检测特异性扩增带的有无,从而判断外源基因是否整合到受体植物的基因组中。,PCR检测的优缺点,优点: 十分灵敏,可以适用于微量的DNA样品的检测;对模板DNA的质量要求不高; 检测结果基本准确; 操作简单 ; 适合转基因体的早期检测。,缺点: 对引物设计的要求较高; 很容易受到外界因素的干扰,出现假阳性扩增; 检测结果不够精确; 即使检测到外源基因,载体携带外源基因进入受体细胞可能以游离的方式存在于基
3、因组外,未能整合到染色体上。,PCR检测所用仪器,PCR 仪,垂直电泳装置,RT-PCR检测外源基因的表达,(1)RT-PCR的基本原理 (2)RT-PCR技术的相关试剂,RT-PCR的基本原理,RT-PCR又名逆转录聚合酶链反应(reverse transcription PCR ) 原理是:提取组织或细胞中的RNA,或以转基因个体总RNA或mRNA作为模板链,采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cRNA。一方面,以cRNA为模板链进行PCR扩增,而获得目的基因。另一方面,以能否获得特异性的cDNA扩增条带实现基因表达的检测。,RT-PCR技术相关试剂,oligo: 多聚体,相当于mRNA引物 AMV(M-MLV):逆转录酶 dNTP:脱氧核苷酸 RNase:RNA酶抑制剂 PCR Buffer:RT-PCR缓冲液 MgCl2:2价镁离子,RT-PCR检测的优劣势,此方法简单、快捷、对mRNA抽提的数量和质量要求都不高。 但是和PCR技术一样,RT-PCR也存在假阳性的问题,所以外援基因的转录的最后确定,还需要用Northern杂交的结果进行验证。,谢谢!,