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1、乙肝病毒的检测,1.乙型肝炎病毒 2.乙肝五项的各项简述 3.乙肝五项32种可能组合 4.乙肝五项检测的影响因素 5.乙肝DNA检测的临床意义 6.乙肝DNA与乙肝五项的关系 7.客观看待乙肝DNA,乙型肝炎病毒HBV,HBV是嗜肝脱氧核糖核酸病毒科的哺乳动物属的一员。 HBV阳性的血清中有三种病毒颗粒 .大球形颗粒，完整的HBV颗粒直径为42nm，又名Dane颗粒，分为包膜与核心的两部分，外衣壳及包膜含有表面抗原，衣壳内为核心结构，有核心抗原，核心抗原下面藏有e抗原。,.小球形颗粒，阳性血清中最多的颗粒，主要为表面抗原，不含核酸及成分，为不完整的 .管形颗粒，实际上是一串小球形颗粒聚合在一起
2、的，也含有表面抗原,乙肝五项的各项简述,1HBsAg HBsAg于1963年在澳大利亚土著人血中发现，称为澳大利亚抗原(即以前所谓的“澳抗”，1974年正式定名为乙型肝炎表面抗原(简称为HBsAg)，存在于HBV的外壳部分。血清中检出HBsAg是乙型肝炎的早期诊断指标之一，出现于患者血清转氨酶(ALT)升高前28周，至恢复期HBsAg滴度逐步降低乃至消失，抗HBs出现。但有部分患者HBsAg在血清中可持续存在，原因可能是编码HBsAg的HBV的s区段和肝细胞DNA整合。在这种情况下，即使HBV已从人体内消除，肝细胞仍能不断地复制HBsAg。HBV感染后，大部分人没有临床表现，但在血中可检出HB
3、sAg，这类人通常称为HBsAg携带者。在我国这类人超过1亿，其中大部分将持续携带HBsAg数年、数十年乃至终身而无临床症状；小部分人在平衡被打破后，可发展为急性或慢性乙型肝炎，甚至肝硬化、肝癌。 HBV感染后绝大多数感染者外周血中可出现HBsAg， 含量在5ng600g/ml之间。据文献报道，到目前为止在献血员中所发现的HBsAg 携带者最低含量为0.2 ng/ml。含量高者可达2000g/ml以上。但有少部分HBV感染者血清HBsAg测定为阴性，如暴发性乙型肝炎。急性重症乙型肝炎，肝细胞中以合成HBcAg为主，很少或不合成HBsAg，从而使外周血中无HBsAg。 。同时乙肝疫苗接种也不能有
4、效预防此类变异病毒的感染等HBsAg不仅存在于血液中，而且还存在于许多体液和分泌物中，如唾液、尿液、乳汁、精液等。 目前国内最常用的HBsAg免疫测定方法为酶联免疫吸附试验(ELISA)，其次是放射免疫试验(RIA)。ELISA简单、方便、快速，测定下限进口试剂盒可达0.2 ng/ml，国产试剂盒目前也能达到0.5 ng/ml。 RIA因其试剂半衰期短、废物难于处理等，使用已很受局限。血清HBsAg仅为HBV感染的标志。由于其在血液中多为不含病毒颗粒的空壳，故而不反映病毒有无复制、复制程度、传染性强弱及预后。,2抗HBs 当乙型肝炎病毒侵入人体后，刺激人的免疫系统产生免疫反应，人体免疫系统中的
5、B淋巴细胞分泌出一种特异的免疫球蛋白G，就是表面抗体，它可以和表面抗原特异地结合，然后在体内与人体的其他免疫功能共同作用下，可以把病毒清除掉，保护人体不再受乙肝病毒的感染，故称表面抗体为保护性抗体。有了表面抗体，证明人已产生了免疫力。人自然感染后或注射乙肝疫苗后，均可产生乙型肝炎表面抗体；但不是所有的人都能产生表面抗体。一般成人期感染乙型肝炎病毒，可以发生急性乙型肝炎，也可没有症状，绝大多数在36个月以后才出现表面抗体。检查出抗-HBs阳性，疾病即已逐渐恢复。血液里表面抗体能维持很长时间，直到老年期抗体水平才有所降低。以HBsAg作为疫苗免疫机体产生的抗HBs，对HBV的感染具有保护性免疫作用
6、。10mIU/m1抗HBs为对HBV具有免疫力的临界水平。低于此值，说明免疫失败。乙肝疫苗接种者，体内血循环中除了抗HBs外，不应出现其它乙肝病毒感染血清免疫学标志物，如抗HBe、抗HBc等。一旦出现除抗HBs以外的标志物，则应视为既往HBV感染。 一般情况下，血清中抗HBs和HBsAg不同时存在，若同时检出，可能为抗HBs产生的早期，或属于不同亚型的HBV感染，或由HBV的S基因变异所致。,HBV的S基因发生变异, 使得其原来的甘氨酸被精氨酸替代时，可致a决定簇的抗原性发生改变，使机体产生的抗体对变异株无作用，且可引起HBV感染患者血清中同时出现HBsAg和抗HBs,乙型肝炎病毒S基因的变异
7、有自然变异和逃避免疫变异，变异可发生在多个部位，而且几处突变可同时存在，这些变异有助于病毒携带状态的持续存在,3HBeAg HBeAg一般通称e抗原，它来源于乙型肝炎病毒的核心，是核心抗原的亚成分，或是核心抗原裂解后的产物。e抗原是可溶性蛋白。当核心抗原裂解时，可溶性蛋白部分（即e抗原）就溶于血清中，存在于血液循环中，若取血化验就可查出来 ，两者约有75共同的氨基酸序列，但二级结构不同，各有特异的抗原决定簇，因而在细胞水平其体液免疫应答是不同的。其在血清中的出现时间稍后于HBsAg，一般血清HBeAg阳性者，HBsAg亦为阳性。有研究表明，当乙肝病毒的前核心区发生点突变时，可使得HBeAg无法
8、表达，表现为血清HBeAg或抗HBe测定持续为阴性，但血清HBsAg或HBV DNA可表现为阳性。 HBeAg与病毒Dane颗粒、HBV DNA具有伴随关系，是HBV复制活跃的血清学指标，血清HBeAg阳性说明传染性强。急性乙肝病人血清HBeAg持续阳性3个月以上，则有疾病慢性化倾向。 有时临床实验室可见到HBsAg（）、抗HBs（+）、HBeAg（+）的模式，则很有可能在病毒编码HBsAg的基因区发生了突变。,4抗HBe e抗体是乙型肝炎e抗体的简称（抗-HBe），它是由e抗原刺激人体免疫系统产生出来的特异性抗体，这种特异的e抗体能够和e抗原结合，当血清HBeAg转阴后，可出现抗HBe，两者
9、同时阳性较少见。但抗-HBe和抗-HBs不同，e抗体不是保护性抗体，不代表患者有了免疫力。有时虽然检查出e抗体阳性，但肝细胞内仍然可以查出乙型肝炎病毒DNA，表明病毒仍然存在。大量研究资料表明，e抗体出现阳性是病毒复制降低并且传染减少的标志，这时病毒颗粒有可能已经很少，但并不表示病毒已被消除了。,5总抗HBc和抗HBc IgM 核心抗体是乙型肝炎核心抗体的简称，可简写为抗-HBc。核心抗原虽然在血清中查不出来（它在血中很快被裂解），但是它具有抗原性，能刺激身体的免疫系统产生出特性抗体，即核心抗体，故检测抗-HBc可以了解人体是否有过核心抗原的刺激，也就是说是否有过乙肝病毒的感染，从机体对HBV
10、抗原的免疫应答来看，最早出现的是对HBcAg的细胞免疫应答(HBcAg的免疫原性最强)，随后才发生对HBcAg的体液免疫应答产生抗HBc。总抗HBc包括抗HBc IgM、IgA、IgG和IgE等。抗HBc IgM可以说是机体感染HBV后在血液中最早出现的特异抗体，在乙型肝炎的急性期呈高滴度，是判断急性乙型肝炎的重要指标。随着急性乙肝的恢复，抗HBc IgM滴度(以及抗HBc IgA)降低乃至消失。如持续高滴度，则常表明病人乙肝有慢性化倾向。研究表明，在慢性活动性乙型肝炎患者血循环中，抗HBc IgM检出率及滴度亦较高，说明HBV在体内复制活跃，是传染性强的指标之一。抗HBc不是保护性抗体。抗H
11、Bc在血中呈低滴度且与抗HBs同时存在，是既往感染的标志。,乙肝五项的32种组合,乙肝五项检测的影响因素,1. 样本采集与处理的影响 1.1标本严溶血及混有红细胞的血清易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净，残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶样的活性，催化底物显色造成假阳性，严重溶血标本禁用。 1.2塑料试管能吸附抗原物质，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性。最好使用一次性玻璃试管或真空管采血管；并使用非抗凝标本，肝素抗凝血浆会增加OD值，可能与高浓度肝素具有强大的负电荷能吸附酶标记物不易洗脱有关；EDTA、酶抑制剂（如NaN3）可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性。 1.3标本
12、凝固不全 ，正常血液采集后1/22h开始凝固，1824h血块完全收缩。在工作中，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果；因此血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。,2、试剂的影响 2.1乙肝两对半试剂厂家较多；不同厂家出产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别，有资料显示，不同厂家试剂的特异性和敏感性分别为89.4%99.3%,7889%存在较大差异。有的厂家酶标板孔间A值差大于15%；标记酶的活性及显色液
13、的稳定比较差。使用质劣的试剂必然导致结果的假阳性或假阴性。因此。选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之一。 2.2不同方法学的检测试剂，会使两对半结果出现一些不同。例如：在实际工作中常用ELISA检测HBsAg结果为阴性，而电化学发光检测为阳性。除方法学的灵敏度外；还存在使用单抗或多克隆抗体试剂的差别。单抗对变异抗原或亚型乙肝标志物检测存在差异，建议试剂厂家对剂的制备应该考虑亚型及型浓度的问题。,3、操作技术的影响 3.1加样吸嘴的洁净与否和吸量的准确性，直接影响检测结果。由于吸嘴构造特殊，导致清洗困难，加大了交叉污染的机会。建议用一次性吸嘴。加样器也要经常清洗，定期校准。 3.2温浴影响，9
14、6孔酶标板结构特别；易产生边缘效应，抗原抗体结合及酶促反应对温度有严格要求，酶标板周围与内部孔升降温速率不同，造成周边与内部孔结果差异；干浴与水浴存在明显的差异，尽可能使用水浴，并要求固相板放入水中，减少受热不均，贴密封膜，防止污物浸入。 3.3冼涤是ELISA操作的重要环节，手冼条件一致性较差，对结果影响较大，半自动与全自动冼板机使用不当也会影响结果，血清中残留的的纤维蛋白丝或洗涤液析出的结晶易使洗板机针小孔全阻塞或半阻塞状态，造成未结合标记酶洗脱不彻底，导致“花板”造成假阳性或假阴性；所以操作洗板机过程中要不时观察洗板机针孔内洗液的通畅状况，及时纠正，洗板机不用时应用去离子水清冼几遍。 3
15、.4肉眼判断结果时，显色浅不易观察，影响结果的准确性，必须使用酶标仪检测，以保结果一致性。,4、HooK效应影响 随着ELISA一步法的应用，一些标本中抗原含量过高，产生HooK效应。影响检测结果，采用同步稀释测定或使用线性范围高的两对半定量法可以减HooK反应的发生。,5、干扰物质的影响 有人认为大约40%的人血清标本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结果；常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠Ig 抗体、交叉反应物质和其它物质等。如RF因子可与标记二抗的FC段法结合造成假阳性，补体从C1q活化，使一抗和酶标二抗的抗体分子发生变构，Fc的
16、C1q分子结合点暴露出来，则补体C1q可将二者连接起来造成假阳性，采用5630分钟灭活补体可降低假阳性率，高浓度的AFP（如孕妇），在储存过程中可能形成二聚体会导致本底过深影响检测结果。,6、药物的影响 6.1、高效价的乙肝免疫球蛋白会与HBsAg形成复合物，影响HBsAg的检出，所以一些HBsAg阳性患者注射乙肝免疫球蛋白后，HBsAg检测会呈阴性反应，导致乙肝两对半少见模式的出现，如我们常遇到乙肝大三阳的孕妇，为阻断乙肝母婴垂直传播时，在孕第8、9、10月常规注射乙肝免疫球蛋白，不仅影响孕妇HBsAg的检出；而且其所生产的生新儿也常出现HBsAg阴性，HBeAg 阳性和HBcAb阳性等少见模式、可能是乙肝免疫球蛋白属IgG抗体能通过胎盘进入胎儿体内与胎儿血液中的HBsAg结合形成复合物；则新生儿HBsAg检测呈阴性；用0.5M的盐酸处理标本1小时可提高出率。 6.2、为预防乙肝，部分HBsAg阴性人群在接种乙肝疫苗后的12周内，血清中可检出
