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1、 实验论文胰蛋白酶的分离纯化及动力学研究学 院： 化工与材料学院专 业： 姓 名： 班 级：生物工程学 号： 指导老师：中国珠海二一六年四月诚信承诺书本人郑重承诺：本人承诺呈交的毕业设计胰蛋白酶的分离纯化及动力学研究是在指导教师的指导下，独立开展研究取得的成果，文中引用他人的观点和材料，均在文后按顺序列出其参考文献，设计使用的数据真实可靠。本人签名： 日期： 年 月 日胰蛋白酶的分离纯化及动力学研究摘要本实验通过用有机溶剂沉淀法和离心法提取胰蛋白酶的专一性抑制剂-鸡卵类粘蛋白（CHOM）作为亲和配基，运用了Bradford法定量测定蛋白质浓度再利用亲和层析法对胰蛋白酶进行分离纯化，然后通过用抑
2、制剂对酶反应速度的影响来了解酶促反应，掌握其规律，为了最大限度地实现酶促反应的高效率、寻找最有利的反应条件以及了解酶在代谢中的作用和某些药物的作用机理等，都需要掌握酶促反应速度的规律。最后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行酶纯度检验以及其相对分子量的测定。关键词：胰蛋白酶；鸡卵粘蛋白；亲和层析法；米氏常数；酶促反应动力；聚丙烯酰胺凝胶电泳Trypsin of isolation and purification and dynamic researchAbstractThis experiment through with organic solvent precipitation method an
3、d centrifugal method extraction trypsin of specific sex inhibitors-chicken eggs class stick protein (CHOM) as Affinity distribution base, using has Bradford method quantitative determination protein concentration again using affinity chromatography method on trypsin for separation purification, then
4、 through with inhibitors on enzyme reaction speed of effect to understand enzyme promoting reaction, master its law, to maximum to achieved enzyme promoting reaction of efficient, and To find the most favorable conditions and the role of the enzyme in the metabolic mechanism and effect of certain dr
5、ugs, needs to master the law of speed of enzymatic reactions. Finally, polyacrylamide gel electrophoresis of enzyme purity test and the determination of its molecular weight.Key words: trypsin; egg protein; affinity chromatography;-Menten constant; enzymatic reaction force; Polyacrylamide gel electr
6、ophoresis目录摘要IAbstractII目录III1前言11.1研究背景11.2胰蛋白酶简要介绍11.3蛋白分离纯化方法综述11.3.1沉淀法11.3.1.1盐析法11.3.1.2有机溶剂沉淀法21.3.1.3蛋白质沉淀剂21.3.1.4聚乙二醇沉淀作用21.3.1.5选择性沉淀法21.3.2吸附层析21.3.2.1吸附柱层析21.3.2.2薄层层析21.3.2.3聚酰胺薄膜层析21.3.3离子交换层析31.3.4凝胶过滤31.3.5亲和层析31.3.6聚焦层析41.3.7气相色谱41.3.8高效液相色谱41.4胰蛋白酶研究进展42实验原理52.1胰蛋白酶的亲和配基-鸡卵粘蛋白的分离与
7、定量52.1.1蛋白质沉淀52.1.1.1盐析52.1.2蛋白质定量52.2亲和层析法分离纯化胰蛋白酶52.2.1亲和层析法的各项要素52.2.2亲和层析法介绍62.2.3胰蛋白酶活性测定62.3酶动力学研究72.3.1米氏方程72.3.2抑制动力学72.4聚丙烯酰氨凝胶电泳82.4.1 PAGE 凝胶的组成82.4.2电泳的浓缩作用82.4.3 PAGE 染色及干燥83实验材料（设备）93.1实验材料93.1.1实验原料93.1.2实验原料来源93.1.3凝胶配置93.1.3.1 Disc-PAGE/SDS-PAGE分离胶（T=12%,C=3%）配方93.1.3.2 Disc-PAGE/SD
8、S-PAGE浓缩胶（T=5%Acrylamide,C=3%）配方103.1.4.实验试剂103.1.5实验主要设备与仪器104实验方法114.1实验流程示意图114.2胰蛋白酶的亲和配基-鸡卵粘蛋白的分离与定量124.2.1有机溶剂沉淀法124.2.2 TCA沉淀法124.2.3高速离心法134.2.1蛋白质盐脱134.2.1 Bradford法定量蛋白质134.3亲和层析法分离纯化胰蛋白酶134.3.1 N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）法134.4酶动力学研究144.4.1双倒数作图法(Lineweaver-Burk)测定Km144.5聚丙烯酰氨凝胶电泳144.5.1蛋白质相对分子量的
9、测定145实验结果与分析讨论155.1胰蛋白酶的亲和配基-鸡卵粘蛋白的分离与定量155.2亲和层析法分离纯化胰蛋白酶165.3酶动力学研究185.4聚丙烯酰氨凝胶电泳197结论21参考文献22附录231前言1.1研究背景蛋白质分离纯化是用生物工程下游技术从混合物之当中分离纯化出所需要得目的蛋白质的方法。是当代生物产业当中的核心技术。该技术难度、成本均高。1蛋白质在细胞和生物体的生命活动过程中（包括催化代谢反 应、 物质运转、兴奋的传导、生长发育的控制等）起着重要的作用，因此，蛋白质是生命科学极为重要的研究对象。蛋白质的分离纯化是蛋白质研究中不可缺少的环节，只有了解蛋白质的分子量、溶解性、等电点
10、以及稳定性等基本性质，才能达到有效分离。2酶促反应动力学（kinetics enzyme-catalyzed reactions）主要研究各种理化因素对酶促反应速度的影响。在酶的结构与功能关系以及酶作用机理的研究中，需要动力学研究提供实验证据。为了最大限度地实现酶促反应的高效率、寻找最有利的反应条件以及了解酶在代谢中的作用和某些药物的作用机理等，都需要掌握酶促反应速度的规律。因此，酶促反应动力学是酶学研究中的一个既具有重要理论意又具有实践意义的课题。影响酶促反应速度的因素主要有底物的浓度、酶的浓度、温度、pH 值、酶的激活剂及抑制剂等。1.2胰蛋白酶简要介绍胰蛋白酶Trypsin (Paren
11、zyme) 为蛋白酶的一种，EC 3.4.4.4，是从牛、羊、猪的胰脏提取的一种丝氨酸蛋白水解酶。在脊椎动物中，作为消化酶而起作用。在胰脏是作为酶的前体胰蛋白酶原而被合成的。作为胰液的成分而分泌，受肠激酶，或胰蛋白酶的限制分解成为活化胰蛋白酶，是肽链内切酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。它不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用。是特异性最强的蛋白酶，在决定蛋白质的氨基酸排列中，它成为不可缺少的工具11.3蛋白分离纯化方法综述1.3.1沉淀法沉淀法也称溶解度法。其纯化生命大分子物质的基本原理是根据各种物质的结构差异性来改变溶
12、液的某些性质，进而导致有效成分的溶解度发生变化。1.3.1.1盐析法盐析法的根据是蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升，但当盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间互相凝聚并从溶液中析出。1.3.1.2有机溶剂沉淀法有机溶剂能降低蛋白质溶解度的原因有二：其一、与盐溶液一样具有脱水作用；其二、有机溶剂的介电常数比水小，导致溶剂的极性减小。1.3.1.3蛋白质沉淀剂蛋白质沉淀剂仅对一类或一种蛋白质沉淀起作用，常见的有碱性蛋白质、凝集素和重金属等。1.3.1.4聚乙二醇沉淀作用聚乙二醇和右旋糖酐硫酸钠等水溶性非离子
13、型聚合物可使蛋白质发生沉淀作用。1.3.1.5选择性沉淀法根据各种蛋白质在不同物理化学因子作用下稳定性不同的特点，用适当的选择性沉淀法，即可使杂蛋白变性沉淀，而欲分离的有效成分则存在于溶液中，从而达到纯化有效成分的目的。1.3.2吸附层析1.3.2.1吸附柱层析吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。1.3.2.2薄层层析薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，然后按纸层析操作进行展层。1.3.2.3聚酰胺薄膜层析聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物
14、之间形成氢键。这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程，就能导致分离物质达到分离目的。1.3.3离子交换层析离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。1.3.4凝胶过滤凝胶过滤又叫分子筛层析，其原因是凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排除在外部。当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。1.3.5亲和层析亲和层析的原理与众所周知的抗原-抗体、激素-受体和酶-底物等特异性反应的机理相类似，每对反应物之间都有一定的亲和力。正如在酶与底物的反应中，特异的底物（S）才能和一定的酶（E）结合，产生复合物（E-S）一样。在亲和层析中是特异的配体才能和一定的生命大分子之间具有亲和力，并产生复合物。而亲和层析与酶-底物反应不同的是，前者进行反应时，配体（类似底物）是固相存在；后者进行反应时，底物呈液相存在。实质上亲和层析是把具有识别能力的配体L（对酶的配体可以是类似底物、抑制剂或辅基等
