植物组织培养教程+李浚明3

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1、第二章 植物组织培养 的基本原理,影响植物离体形态发生的因素,细胞全能性和细胞分化,器官发生,体细胞胚胎发生,知识点:,基本概念：植物细胞全能性、细胞分化、 脱分化、再分化 植物离体培养中再生植株有哪些途径？ 愈伤组织是如何形成与生长的？ 植物体细胞胚胎发生有哪些途径？ 影响植物离体形态发生的因素有哪些？,？,第一节 植物细胞全能性和细胞分化,植物组织培养的核心理论： 植物细胞全能性理论（Haberlandt, 1902）。,细胞全能性概述,细胞脱分化,细胞再分化,定义：1902年由Haberlandt提出，即植物体细胞在适当的条件下，具有不断分裂和繁殖、发育成完整植株的能力。 20世纪80年

2、代，每一个植物细胞具有该植物的全部遗传信息，在适当条件下可表达出该细胞的所有遗传信息，分化出植物有机体所有不同类型细胞，形成不同类型的器官甚至胚状体，直至形成完整再生植株。,一、植物细胞的全能性（Totipotency）,从一个细胞发育成一个植株,植物细胞全能性的证明是通过1958年Steward等胡萝卜根段细胞体胚发生试验及1964年Guha等进行的曼陀罗花药培养。,细胞全能性的相对性: 细胞全能性并不意味着任何细胞均可以直接产生植物; 动植细胞全能性的表现程度存在明显的差异.,细胞按照分裂能力分为三类:,第一类是始终保持分裂能力,如茎尖、根尖及形成层细胞； 第二类是永久失去分裂能力的终端分

3、化细胞，如筛管、导管、气孔保卫细胞等特化细胞； 第三类是在通常情况下不分裂，但在受到外界刺激后可重新启动分裂的细胞。如表皮细胞及各种薄壁细胞。,一个植物细胞向分生状态回复过程所能进行的程度，取决于它在自然部位上所处位置和生理状态。,根据细胞类型不同从强到弱: 营养生长中心形成层薄壁细胞厚壁细胞（木质化细胞）特化细胞（筛管、导管细胞） 根据细胞所处的组织不同从强到弱： 顶端分生组织居间分生组织侧生分生组织薄壁组织（基本组织）厚角组织辅导组织厚壁组织,植物细胞全能性理论是植物组织培养的核心理论。离体细胞具有生命的特征属性，在全能性的基础上，提供合适的营养和环境条件，离体细胞经历脱分化（dediff

4、erentiation）和再分化（redifferentiation）过程，可形成再生植物。,1、定义： 分化（differentiation）：是指植物体各个部分出现异质性的现象，体现在细胞分化、组织分化、器官分化三个水平上。 细胞分化：指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在的发育方式改变的过程。是基因选择性活化或阻遏的结果。 细胞分化是组织分化和器官分化的基础，是离体培养再分化和植株再生得以实现的基础。,二、植物细胞分化,2、植物细胞分化的某些规律和机理,（1） 细胞分化分为形态结构分化和生理生化分化两类，生理生化分化在形态结构分化之前。 （2）植物中细胞发育的途径一旦被“决定”（de

5、termination），通常不易改变。而离体培养可以通过脱分化而丧失这种“决定”。 （3）分化与极性（Polarity）关系密切。,（4） 细胞分裂对细胞分化具有重要作用。特定环境条件下进行的细胞分裂可以导致特定的细胞分化，由不等分裂形成的分化细胞说明了细胞质在细胞分化中的作用。 （5）植物生长调节剂有明显调节作用。如生长素与分裂素比值，高，促进生根；低，促进长芽。 （6）染色体和DNA的变化对细胞分化影响比较大。如核内多倍体的形成。,三、细胞脱分化 1、脱分化（Dedifferentiation）：也称去分化，指离体条件下生长的细胞、组织或器官经过细胞分裂或不分裂逐渐失去原来的结构和功能而

6、恢复分生状态，形成无组织结构的细胞团或愈伤组织或不分化细胞的过程。 如叶柄基部的薄壁细胞成为离层细胞；伤害导致局部细胞形成愈伤组织。,脱分化诱导期间会导致细胞膜透性改变，细胞核增大，内质网范围扩大，多核糖体形成，过氧化物酶增加，蛋白质和酚类物质合成活跃等。但目前对于脱分化的机理尚未完全阐明。,2、脱分化的机理,（1）损伤。切割损伤的刺激，促使细胞增殖。 （2）在诱导愈伤组织时常加入生长素类，但同时配合细胞分裂素的效果可能更好。 （3）弱光或黑暗条件有利于脱分化中的细胞分裂。 （4）细胞位置。外植体本身的各类细胞可能对培养条件的刺激有不同的敏感性。 （5）外植体的生理状态。不同生理年龄和不同季节

7、都会有不同的培养反应。 （6）植物种类的差异。 一般双子叶植物比单子叶植物及裸子植物容易。,3、影响脱分化的主要因素,三、愈伤组织（callus）培养 、愈伤组织的形成 在细胞脱分化过程中，大多数情况下形成愈伤组织。愈伤组织的细胞往往是异质性的，无明显极性，其形成过程可分为诱导期、分裂期和分化期。,黄瓜子房组织经脱分化形成胚性愈伤组织,诱导期（起动期）：是细胞准备分裂的时期。细胞大小几不变，内部发生生理生化变化，迅速合成蛋白质和核酸。 分裂期：外层细胞分裂，中间细胞常不分裂，形成小芯。细胞分裂快，结构疏松，缺少结构，浅而透明。在原培养基上，细胞必分化，及时转移，其可无限制地进行细胞分裂，维持不

8、分化状态。 分化期：细胞在形态和生理功能上的分化，出现形态和功能各异的细胞。,形成过程（三个时期）：,（1）生长：诱导期后，外植体外层细胞分裂，在组织受伤表面形成一层愈伤组织， 细胞数目迅速增多，表层细胞平均重量下降，体积变小；降低温度，可以使细胞生长速度减慢，平均大小可增加。 （2）质地类型：松脆和致密两种。高浓度生长素，可使Callus变得松脆；高浓度细胞分裂素，则可使致密。 （3）生理生化变化：次生物质合成能力变化，对激素的需求变化等。,2、愈伤组织的生长,3、愈伤组织的保持 转接,在多数情况下，随着继代培养代数增加和培养时间的延长，Callus长势下降、褐变、分化和形态发生能力下降、降

9、低甚至死亡。所以在此之前，应及时转接至新鲜培养基上。 主要原因：遗传因素，染色体畸变、基因突变； 生理因素，细胞或组织内激素平衡的改变，细胞对外源生长物质的敏感性改变。后者可以通过调控培养条件而恢复。,4、愈伤组织形态发生,（1）过程：外层细胞分裂，逐渐减慢并停止；内部较深处的细胞开始分裂，而且分裂方向也发生改变，形成微管化组织和瘤状结构。 （2）形态发生方式：器官发生和体细胞胚胎发生。,器官发生,体细胞胚胎发生,四、细胞再分化（redifferentiation） 1、概念 ：指离体培养的植物细胞和组织可以由脱分化状态重新进行分化，形成另一种或几种类型的细胞、组织、器官，甚至形成完整植株。,

10、组织培养中的再分化包括下面4个水平：,细胞水平的再分化 组织水平的再分化 器官水平的再分化（器官发生） 植株水平的分化（植株再生）,细胞水平的再分化：愈伤组织生长、不断分裂，分化出不同的细胞类群。主要有薄壁细胞、分生细胞、色素细胞、石细胞、纤维细胞等。,组织水平的再分化：在高水平生长素条件下，最常见的是微管束（Vascular tissue）的分化。松散的愈伤组织内含大量拟分生组织或瘤状结构；致密的愈伤组织内组织分化很少，大多由高度液泡化的细胞组成。,器官水平的再分化：由分化出的不同组织形成各种器官，如芽、茎、叶、根等。 根据起源不同，分为两种类型： 直接器官发生（器官型）：直接从外植体的细胞

11、形成器官原基，然后发育成器官。 间接器官发生（器官发生型）：先形成愈伤组织，再由愈伤组织产生不同的器官原基，后形成不同器官。,植株水平的再分化（植株再生）：根、茎或芽器官的发生可使植株重建。先诱导分化出芽，后形成根较好。 离体培养中再生植株的主要途径有： 器官发生 胚胎发生,2、影响细胞再分化因素： 从理论上讲，在离体培养条件下经过再分化可获 得各种类型的细胞、组织、器官以及再生植株。但是目前，还不能让所有植物的活细胞都再生植株。主要原因是： （1）不同植物种类再分化的能力差异很大； （2）对某些植物再生条件还没有完全掌握。,第二节 离体条件下植物器官发生,植物的离体器官发生是指培养条件下的组

12、织或细胞团（愈伤组织）分化形成根、芽、茎等器官的过程。不定根、不定芽是指在一些非正常发生部位形成的根或芽，离体培养中通常是指从愈伤组织上发生的根或芽。,一、器官发生再生植株的方式： A 先形成芽，芽的基部后产生后根； B 先形成根，根上再出芽； C 愈伤组织的不同部位形成芽和根，然后形成微管束组织把两者结合起来.,二、器官发生的过程： 分为两种： 经过愈伤组织的器官发生 不经过愈伤组织的器官发生,经过愈伤组织的器官发生过程,愈伤组织形成,生长中心形成,器官原基及器官形成,不经过愈伤组织的器官发生过程,有两种情况： 外植体直接发生芽 茎尖培养中芽形成,第三节 植物体细胞胚胎发生,一、什么是植物体

13、细胞胚胎发生？ 定义：植物离体培养的细胞、组织、器官产生类似胚的结构，其形成也经历一个类似合子胚胎发生和发育过程，这种现象称为植物体细胞胚胎发生，形成的类似胚的结构称为体细胞胚或胚状体。 体细胞胚胎发生具有普遍性，目前已在200多种被子植物上观察到体胚发生过程。,合子胚的 发生过程,双子叶植物胚胎发生： 合子原胚球形胚心型胚鱼雷胚子叶胚 单子叶植物胚胎发生： 合子原胚球形胚盾型胚子叶胚 体细胞胚胎发生与合子胚发生阶段类似，但体胚形成由体细胞（或小孢子等性细胞）形成。,合子心型胚 正在萌发的体胚,合子胚与体胚比较,1、发生过程： 一般分为5个阶段：胚性愈伤组织诱导、体细胞胚胎诱导、体细胞胚胎早期

14、分化发育、体细胞胚胎成熟、体细胞胚胎萌发和成苗。 双子叶植物：体胚经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚到子叶胚等阶段。 单子叶植物：与双子叶植物诱导发生过程类似，只是在形态上无鱼雷形胚等阶段，成熟体胚上有盾片、胚芽鞘和胚根等结构。,二、体细胞胚胎发生过程,挪威云杉体细胞胚胎发生及体胚生长状态,针叶松体细胞胚及体胚萌发生长,（1） 胚性愈伤组织，通常较小，近圆形，具有较大的核和核仁，并高度染色，胞质浓厚。典型的胚性愈伤组织外表呈松脆颗粒状。 （2）胚性细胞DNA、RNA以及蛋白质的合成更活跃，淀粉、可溶性糖含量增加，内源多胺含量升高，同工酶和内源激素合成变化明显。 如胡萝卜胚性愈伤组织淀粉含量高出非

15、胚性愈伤组织的1540倍。,2、胚性和非胚性细胞或愈伤组织生理状态的差异,3、体细胞胚胎发生的基因表达机理,植物体胚发生的过程非常复杂，牵涉到4000多个相关基因，以体胚发育后期，表达的基因可达1000多个。 在植物体胚发生过程中，会出现与基因表达有关的一系列生物大分子的有规律变化. 如蛋白质含量变化和特异蛋白质（胚性蛋白）出现与消失。 由于其复杂性，目前对体胚发生的机制了解不多。,三、植物体细胞胚胎发生途径,1、直接途径：指从外植体某些部位的胚性细胞直接诱导分化出体细胞胚胎，如子叶、花序、珠心等外植体。,Direct somatic embryogenesis in Brassica nap

16、us,外植体先脱分化形成愈伤组织，再由愈伤组织的某些细胞重新“决定”为胚性细胞，进而分化出体细胞胚胎。多数体细胞胚胎通过该途径形成的。通常包括2个阶段： （1）胚胎发生丛（Embryogenic clump）EC是由液泡小、细胞质浓的小细胞构成。 （2）胚状体的发育。将EC转入降低或除去生长素、降低还原氮的培养基上培养即可。,2、间接途径:,Somatic Embryogenesis Induction in Delonix regia (Boger.) Raf (Royal Poinciana),花椰菜体胚发育的不同阶段,菊花花瓣体细胞胚胎发生及体胚发育过程的扫描电镜观察,四、体细胞胚胎发生的机理 1、体细胞胚胎的起源： 起源存在争论，但绝大多数体细胞胚胎起源于单细胞。 细胞胚发生的实质是细胞分化，即细胞在离体培养条件下，诱导部分基因开放，实现遗传信息的表达。,2、体细胞胚胎发生机理： 体胚具有两个明显特点：极性和生理隔离 极性：单个胚性细胞第一次分裂多为不均等分裂，顶细胞继续分裂形成多细胞原胚，基细胞进行少数几次分裂形成胚柄。