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1、Molecular and pharmacological characterization of dominant black coat color in sheep,绵羊黑色显性毛色的分子学和药理学特性,小组成员：杜晓丽 连维思 张秀玲 张淑娜,1.,背景,材料,过程,2.,3.,4.,结果和讨论,背景知识,1、MC1R（melanocortin-1-receptor gene,黑素皮质素受体）在扩展（Extension）位点编码，其中人的MC1R位于16号染色体上。 2、MC1R主要与黑色素合成有关。MC1R属于G蛋白受体家族中最小的受体，它在黑素细胞和黑色素合成激素的互作中起重要的信号
2、传递作用，是-MSH（-促黑色素细胞激素）的受体。,3. Agouti（鼠灰色）基因与MC1R相互作用，agouti基因所编码的蛋白可以抑制-MSH与MC1R的结合，但是在绵羊和小鼠中extension基因对agouti基因具有上位效应，表明了绵羊的黑色是由ED控制。 4. 在编码绵羊MC1R的基因上有两个自然发生的突变，并且这两个突变与黑色毛色呈现共分离。,研究目的：,研究这两个突变点M73K（老鼠上是M71K）和D121N（老鼠上为D119N）所造成的氨基酸改变，会使得配体和受体的结合产生怎样的影响。,材料,选用挪威的DALA绵羊，这种羊在通常情况下是白色的，但是也会出现毛色全黑的情况。
3、总共选22只羊，其中9只黑色，13只白色。,研究过程,PCR扩增MC1R基因并测序； 2. 用PCR-RFLP 技术对M73K和D121突变点进行确定： M73K突变点的确定： （1）在20ul的体系中，加入50ng的DNA，10pmol的上下游引物以及200uM的dNTP, 标准缓冲条件和1 U Taq聚合酶。 （2）基因组DNA在95下变性3min,PCR在95C运行15秒，60C为30秒，和73C为30秒共35个循环。 （3）15ul的PCR产物在20ul反应中用Nla在 37C下消化两小时。 （4）消化过的DNA在4%琼脂糖中进行凝胶电泳。 若是野生型基因存在时，300bp的片段可以被
4、切成118bp,90bp,48bp,27bp以及17bp,若是M73K突变存在时，PCR的产物可以被切成145bp,90bp,48bp和17bp.,D121N突变点的确定： （1）用设计的另一种引物，以及退火温度为95C，延伸时间为45秒，其他条件与M73K中的相同。 （2）15ul的PCR产物在20ul反应中用Mse在 37C下消化两小时。 （3）消化的DNA在2%琼脂糖中进行凝胶电泳。 若是野生型基因存在，754bp的片段不会被切开，当D121N突变存在，754bp切成258bp和496bp.,3.定点诱变,M73K和D121N的突变通过PCR反应进入小鼠的MC1受体编码序列。 （1）设计
5、的两个寡核苷酸的端到端与相反的链杂交，扩增含有小鼠MC1R的整个PBS质粒。 （2）一个引物包含M73K的突变，另一个引物与野生型相互补。 （3）在PCR聚合酶作用下，线性DNA通过琼脂糖凝胶电泳纯化，结合，克隆分离。 （4） mMC1R使用ABI测序仪测序证实。,4.受体表达,将突变了的MC1R亚克隆入pcDNA载体做表达研究。用20毫克DNA转染人胚肾293细胞，使用磷酸钙法。选择开始于转染后72小时含10%小牛血清和1 mg/ml的遗传霉素培养基中。,5.-半乳糖苷酶活性的检测,含有野生型mMc1受体和受体突变体的人胚肾293稳定表达细胞系使用钙磷酸盐法转染-半乳糖苷酶。 （1）4ug的
6、-半乳糖苷酶基DNA在10厘米的板上进行细胞的转染。 （2）在15-24小时后，细胞在96孔板上分裂，每孔大约有20000到30000个细胞，在转染48小时后进行孵化。 （3）细胞用不同浓度的-MSH和NDP-MSH下进行刺激，并在37C， 5% CO2培养箱中培养6小时。 （4）刺激后，细胞被溶解在50 mL裂解缓冲液，冷冻并解冻，再估计-半乳糖苷酶的活性。,6. 配体结合,竞争结合试验在含有野生mMC1受体或是突变受体的稳定细胞系中进行。 （1）将细胞镀在24孔板上，每孔有5106个细胞，在室温下再将其在结合介质中放置45min每孔含30100000 CPM 125I NDP-MSH。 （
7、2）用不同浓度的未标记的-MSH和NDP-MSH与已经标记的NDP-MSH进行竞争性结合。非特异性结合的控制包含1或10uM未标记的-MSH。 （3）45min后，介质被吸收，用1ml的PBS清洗细胞。 （4）用0.5毫升的Gibco的包用于计数含放射性的试管数目。,结果,Met Lys,Asp Asn,在绵羊MC1R基因上的突变：,在D121N处：,在M73K和D121N处PCR-RFLP结果,在M73K处: 条带2、3是白毛绵羊，基因型为E+ E+ 条带4、5是黑毛绵羊，基因型为含有E+/ED杂合子,条带2、3是白毛绵羊，基因型为E+ E+ 条带4、5是黑毛绵羊，基因型为含有E+/ED杂合
8、子,1.,在小鼠MCR1上突变点M71K，M71K和D119N的药理学分析,用不同浓度的-MSH分别刺激野生型，含有M71K突变，及含有M71K和D119N 的曲线,2.,用不同浓度的NDP- -MSH刺激小鼠野生型，M71K，及含有M71K和D119N的曲线,在配体不存在时，M71K的改变可以激活40%MC1R，通过-MSH或是NDP- -MSH可以进一步激活受体。 当D119N存在时，降低了受体结构激活的能力，降低了NDP- -MSH的功效，使得-MSH的功效降低到了不可测量的程度。,3.,4.,小鼠MC1R 的M71K,D119N突变处的竞争结合曲线,竞争性结合的研究表明，M71K受体的
9、IC50低于野生型受体四倍左右，表示配位体的亲和力增加。 另外，在高浓度下配体能够充分激活双突变体，但是结合这种受体不能用配体结合不太灵敏的测定法检测到。,讨论,此外，两突变在家族材料中完全共分离于黑色毛色。M73K和D121N（或两者的组合）可以解释显性的黑色绵羊毛色。 当M71K突变单独存在时可以激活受体，但是当D119N存在时没有这个作用。 当把M71K和D119N都导入，受体构建激活的程度降低了，并且-MSH的功效降低到检查不出的水平，表明D119N的改变对绵羊的黑毛没有重要的影响，M71K存在时会出现类似的表型。 Agouti 基因通常仅在扩展位点的野生型等位基因（E +）出现时表现表型。但是在研究的白羊中，却表现出了功能性的E +等位基因，这还需要进一步研究。,谢 谢 ！,
