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1、MLPA技术在产前诊断中的应用MLPA技术在产前诊断中的应用 廖 世 秀廖 世 秀 河南省医学遗传研究所 河南省产前诊断中心 河南省人民医院 河南省医学遗传研究所 河南省产前诊断中心 河南省人民医院 1 1、高通量：一管反应可同时检测40个左右 核苷酸拷贝数变化 2 2、极少的模板DNA：每次反应只需约10-20ngDNA MLPA 技术的优势技术的优势 多重连接依赖式探针扩增(多重连接依赖式探针扩增(Multiplex Ligation- dependent Probe Amplification ,MLPA):): 2002年由荷兰学者Dr. SchoutenJP首次提出， 其特点 3、准
2、确度高：每个步骤（包括数据分析） 均设计有多个内部对照 4 4、操作较为简单：产物可用琼脂糖凝胶电 泳分离或通过毛细管电泳等进行分离 5 5、成本低，便于用于大量样品分析 6、重复性强：探针的变异系数仅3% 8% MLPA 技 术 原 理 技 术 原 理 一、染色体数目异常一、染色体数目异常 传统染色体核型分析至今仍是国内外染色体 产前诊断的金标准 MLPA技术在染色体非整倍体诊断中应用的主 要优势在于：无需细胞培养、快速、高 效，相对FISH和CGH简单、廉价，适于推 广 目前主要应用于13、18 、 21 、 X和Y染色体 拷贝数的快速诊断 每管每管aneuloid反应包含反应包含8个个1
3、3、18、 21、X染色体探针和染色体探针和4个个Y染色体探针染色体探针 待测样本标化值与对照相应探针的标 化值相比较，得到比值 待测样本标化值与对照相应探针的标 化值相比较，得到比值(Ratio) 每个峰实测面积每个峰实测面积(As)与所有峰面积与所有峰面积 (As)平均值相除而被标准化平均值相除而被标准化 . . . . . . . 21 18 13 X . . . . . . . 21 18 13 X Y 正常 男性 正常 女性 正常 男性 正常 女性 该比值即反应样本该比值即反应样本DNA拷贝数的变化拷贝数的变化 Chr.13 Chr.18 Chr.21 Chr.X Chr.Y 1 正
4、常对照的正常对照的Rito分析图：分析图： 21三体综合征三体综合征 18三体三体 18三体综合征三体综合征 13三体综合征三体综合征 二、二、MLPA技术在缺失技术在缺失/重复突变 产前诊断中的应用 重复突变 产前诊断中的应用 2.1 假肥大性进行性肌营养不良假肥大性进行性肌营养不良（DMD/BMD） DMD是最常见的X连锁隐性遗传致死性肌病，发病 率约为1/3500活产男婴 其分子基础是抗肌萎缩蛋白（dystrophin）基因的 部分缺失、重复或点突变。约65-75%的DMD/BMD患 者是由于Dystrophin基因缺失或重复所致 1. Drosiphin基因基因79个外显子缺失个外显子
5、缺失/重复检测重复检测 正常样本毛细管电泳分析结果图（正常样本毛细管电泳分析结果图（ABI3130 ） 正常样本琼脂糖电泳图正常样本琼脂糖电泳图 正常对照正常对照 DMD2011-8 患者患者 1.DMD患者Drosphin 基因缺失分析 1.DMD患者Drosphin 基因缺失分析 E48/49/50缺失缺失 E48/49/50缺失缺失 E45缺失缺失 E51/52/53/54缺失缺失 DMD2011-19H E2-6缺失缺失 DMD2011-19AF E3-8缺失缺失 2、缺失携带者诊断、缺失携带者诊断 对于没有家族史的女性携带者判断，是目前对于没有家族史的女性携带者判断，是目前 最有效的
6、方式之一最有效的方式之一 DMD29CVS E46-50杂合缺失杂合缺失 DMD3 E8/E9杂合缺失杂合缺失 3、重复突变诊断、重复突变诊断 正常对照正常对照 重复突变患者重复突变患者 4、重复突变携带者诊断、重复突变携带者诊断 重复携带者重复携带者 重复突变患者重复突变患者 我 们 的 体 会我 们 的 体 会 1. 特别适用于散发病例女性携带者的判断特别适用于散发病例女性携带者的判断 DMD29CVS E46-50杂合缺失杂合缺失 如 ： 辛 某 ， 其 子 临 床 诊 断如 ： 辛 某 ， 其 子 临 床 诊 断 DMD,无家族史无家族史 2008年其子行年其子行Disdrophin基
7、 因热点区检测，结果为 基 因热点区检测，结果为47、 50外显子缺失外显子缺失 2011年孕早期在本所进行产 前诊断（ 年孕早期在本所进行产 前诊断（DMD2011-29），结 果为 ），结 果为SRY-, E46-50杂合缺失杂合缺失 间接反映辛某为携带者可能性 极大（后经 间接反映辛某为携带者可能性 极大（后经MLPA证实）证实） 2. 在在DMD产前诊断中，传统的连锁分析技术仍然 必不可少，因其 可以一定程度上排除污染或 者样本混淆问题； 佐证直接基因分析的结果 产前诊断中，传统的连锁分析技术仍然 必不可少，因其 可以一定程度上排除污染或 者样本混淆问题； 佐证直接基因分析的结果 3.
8、 尽管具备内对照，尽管具备内对照，MLPA技术需要严格的外部实 验对照 技术需要严格的外部实 验对照 SMA患者及携带者分析患者及携带者分析 同时对同时对SMN1基因和基因和SMN2基因的拷贝数定量分析基因的拷贝数定量分析 1. SMA基因诊断和产前基因诊断基因诊断和产前基因诊断 2. SMA携带者分析携带者分析 3. SMA的分子分型和预后预测的分子分型和预后预测 吴玉等，MLPA和PCR-RFLP技术用于脊髓性肌萎缩症的基因诊断.中国 计划生育学杂志，2008.9（155）:535-539. 22q11微缺失微缺失 22q11微缺失综合征（22q11D）是先天性心 脏病(CHD)的遗传病因之一，由其引起的CHD预 后不良 染色体22q11区域高密度多重连接探针检测技 术能快速、灵敏、精确定位诊断染色体22q11区 域基因拷贝数异常，适合于CHD的遗传学诊断 22q11微缺失或微重复引起的CHD类型多种 多样，建议所有CHD患者应常规进行遗传学检 测 胎儿超声心动图检查有异常、无论是否合并 有心外畸形，均应当进行22q11微缺失检测或 染色体核型分析，以帮助准确产前咨询
