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1、HPLC的基础知识及应用,2007年10月26日,工业催化与反应器设计实验室内部学术交流活动,徐 帅,Contents,5,样品分析方法的建立,液相色谱的维护及注意事项,软件的简单介绍及示范,1 液相色谱发展历史与分类,1.1 色谱的起源 (1903),M.S. Tswett,IUPAC definition of chromatography (1993) : Chromatography is a physical method of separation in which the components to be separated are distributed between two
2、 phases, one of which is stationary while the other moves in a definite direction. 固定相（stationary phase）：在色谱分离中固定不动、对样品产生保留的一相。 流动相（mobile phase）：带动样品向前移动的另一相。 色谱法：是一种物理化学分离方法，它利用不同组分与两相（固定相和流动相）之间的作用力（分配、吸附、离子交换等）的差别，样品在两相中做相对移动时，各组分在两相间进行多次平衡，使不同物质达到相互分离。,1.2 色谱的定义,1.3 色谱的发展历程,1.4 色谱中的分离过程,色谱中的分离过
3、程,咖啡,流动相,固定相,利用混合物中各组份在不同的两相中溶解、分配、吸附等化学作用性能的差异,当两相作相对运动时,使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离,1.5 色谱的分类,按流动相的物态分: 气相色谱(Gas Chromatography, GC)： 用气体作为流动相(又叫载气) 液相色谱(Liquid Chromatography, LC)： 用液体作为流动相(又叫洗脱剂) 按固定相的形态分: 平面色谱 纸色谱 薄层色谱 柱色谱 按流动相和固定相的相对极性 正相色谱(Normal Phase Chromatography) 固定相的极性大于流动相 反相色谱(Reverse
4、d Phase Chromatography) 固定相的极性小于流动相,HPLC 与 GC 的应用差异,HPLC 与 GC 的应用差异,挥发,非挥发,疏水性,亲水性,糖,环氧化合物,多氯联苯,脂肪酸甲酯,芳香酯,C2/C5 碳氢化合物,无机离子,氨基酸,糖类衍生物,香精油,聚合物单体,甘油三酸酯,磷脂,亚硝胺,有机磷 杀虫剂,酒精,多环芳烃,芳族胺,脂溶性维生素,抗体,天然食用色素,类黄酮,抗生素,腈类,抗氧化剂,乙二醇,脂肪酸,磺胺类,挥发性羧酸,醛酮类,甘草膦,合成食用色素,苯酚,黄曲霉毒素,酶,糖醇,2. 色谱方法基本原理,色谱的主要理论 热力学理论 以相的平衡观点研究色谱过程 塔板理论
5、为代表 (Martin & Synge) 动力学理论 以动力学观点研究各种动力学因素对色谱峰的影响 Van Deemter 方程为代表,Martin,Synge,分离的原理,样品组分在固定相和流动相之间的分配 流动相带动样品经过色谱柱 不同组分与固定相之间相互作用 的强度不同 不同组分在固定相上移动速度不同， 形成分离 分配系数 KD Xm Xs KD1 = Xs / Xm Ym Ys KD2 = Ys / Ym,流动相,固定相,样品组分的分离,进样、分配、移动、流出、分离,KD2 KD1 ，所以 Y 先流出來,分配系数K,分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关。
6、在条件（流动相、固定相、温度和压力等）一定，样品浓度很低时（Cs、Cm很小）时，K只取决于组分的性质，而与浓度无关。这只是理想状态下的色谱条件，在这种条件下，得到的色谱峰为正常峰；在许多情况下，随着浓度的增大，K减小，这时色谱峰为拖尾峰；而有时随着溶质浓度增大，K也增大，这时色谱峰为前延峰。因此，只有尽可能减少进样量，使组分在柱内浓度降低，K恒定时，才能获得正常峰。 在同一色谱条件下，样品中K值大的组分在固定相中滞留时间长，后流出色谱柱；K值小的组分则滞留时间短，先流出色谱柱。混合物中各组分的分配系数相差越大，越容易分离，因此混合物中各组分的分配系数不同是色谱分离的前提。 在HPLC中，固定相
7、确定后，K主要受流动相的性质影响。实践中主要靠调整流动相的组成配比及pH值，以获得组分间的分配系数差异及适宜的保留时间，达到分离的目的。,样品组分分离情况,A. 样品与色谱柱固定相无任何作用 三种样品在 t0 时间流出， 无保留 无保留时间 B. 样品组分保留时间一致 与色谱柱作用力相同 C. 样品组分保留时间不一致 样品各组分与色谱柱作用力不同 D. 实际分离状况 高斯分布曲线,色谱出峰形状,实际出峰形状为高斯分布曲线 (Gaussian curve) 样品的扩散效应,无扩散,样品扩散,分离度,分离度（Resolution) 两个相邻峰的分离程度。以两个组份保留值之差与其平均半峰宽值的比来表
8、示：,R=? 时两峰认为已分开?,不同分离度 R,相邻两吸收峰分离度 R=1.0, 98%, 基线分离 R=1.5, 99.7% R=1.5 時，完全分离（中国药典规定） 两色谱峰被视为 分开,分离度R 的数学表达,分离度R的基本公式 k: 容量因子 (capacity factor) 反映吸收峰的保留特性 : 选择因子 (selectivity factor) 反映相邻两色谱峰的分离程度 色谱过程热力学因素 N: 理论塔板数，反映色谱柱的分离效率 (column efficiency)色谱过程动力学因素有关,柱效,选择因子,容量因子,容量因子 k,测量溶质在固定相和流动相中分布的摩尔数（量）
9、之比 与温度有关 (GC) 与流动相溶剂种类及组成有关 (LC),k 决定样品能进入色谱柱固定相的量 k太小，在固定相上保留太短，很快流出，难以确定保留时间 k太大，在固定相上保留太强，洗脱时间太长， 理想的 k为 15,分离效果与 k 值的最优化,k值的优化 改变溶剂成分、梯度条件 (洗脱强度),选择因子,色谱柱分开两组份的能力 1 时两组分分离 表示两组分在两相间的平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互作用力的差异。,t0,tR1,tR2,Injection,选择因子 的影响因素,影响 的因素 改变流动相成分，包括改变 pH 值 改变柱温 (在 LC 不明显) 改变固定相成分 使用特殊化学
10、效应,理论板数 N,塔板理论 热力学平衡理论 色谱柱效的量化 从分馏法技术衍生而来 分离法依组分挥发性不同而分馏 色谱法依组分分配系数不同而分离 分配系数 K=Cs/Cm 理论板数 N、塔板高度 H 柱效随 N增大和 H减小而增加 分配色谱流程模型,理论塔板数N 与半峰宽W1/2和保留时间的关系如下 在相同保留时间色谱峰越尖锐，则色谱柱效越高,分离效能的最优化,增加容量,增加选择因子,增加柱效,增加 k 值可增加分离度 但会增加分析时间,改变流动相、固定相成分 增加 值可增加分离度 但不能因此影响 k 值,液相色谱仪设备概述,液相色谱仪器组成,溶剂传输系统（泵系统）,进样系统,检测器,工作站,
11、组分收集（选项）,液相色谱仪器结构组成示意图,流动相储液瓶,单元或多元泵,梯度混合器,预柱,手动-进样器 自动-进样器,保护柱,色谱柱,柱后反应器,柱温箱,检测器,馏分收集器,积分仪,工作站,计算机,接口,温度控制单元,样品制备单元,3. 样品分析方法开发,样品预处理,样品预处理的目的是为了纯化样品。 完成纯化的方法有: 稀释- 用一种互溶的且比流动相弱的溶剂或流动相本身稀释样品 过滤- 有不同孔径的过滤材料. 提示: 有的化合物可能吸附在过滤器上，从而影响定量. 离心- 可除去样品中的颗粒物质. 萃取-液液萃取，固相萃取 挥发- 采用惰性气体通过样品鼓泡或抽真空除去溶剂,优化概览,优化应当是
12、系统进行的，也就是说每个参数应当逐步变化. !每次运行只改变一个参数!,目标是在最短的分析时间内获得最好的分离结果.,优化溶剂强度 流速 温度 柱长 固定相*,流动相的选择,流动相的选择原则是： 样品易溶，且溶解度尽可能大。 化学性质稳定，不损坏柱子。 不妨碍检测器检测，紫外波长处无吸收。 粘度低，流动性好。 易于从其中回收样品。 无毒或低毒，易于操作。 易于制成高纯度，即色谱纯。 废液易处理，不污染环境。 反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度如下： H2O甲醇乙腈乙醇丙醇异丙醇四氢呋喃 正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序是： 正己烷乙醚乙酸乙酯异丙醇,系统方法开发,) 选择初始色谱柱 (直
13、径, 长度, 填料粒度 ）- 4.6 x 250 mm, 5 m 使用适当的孔径 初始运行采用与流动相组成条件一致的pH ) 优化 k* (保留) 梯度范围, 时间, 斜率 流动相 - 很小变化 ) 优化回收率 样品的溶解性 温度的作用 键合相的作用 有机改性剂 ) 优化 * (选择性) 温度 键合相 pH (最后的手段) ) 优化 N (色谱柱条件) 流速 长度 填料粒度,分离度与 k, N, 和 的关系,梯度范围, 斜率,流速, 填料粒度, 柱长,温度、流动相、pH,色谱的定性分析,色谱定性分析: 用保留值定性和色谱联用技术（如LC-MS、LC-FTIR)定性 利用保留值定性 基本依据：两
14、个相同的物质在相同的色谱条件下应该有相同的保留 值。但是，相反的结论却不成立，即在相同的色谱条件 下，具有相同保留值的两个物质不一定是同一个物质 利用已知物直接对照进行定性分析 用绝对保留值定性一般要求用自动进样 用相对保留值定性 用已知物增加峰高法定性 利用文献值对照进行定性分析采用保留指数(I),检测器信号响应与时间的关系 测量每个峰的保留时间,色谱的定量分析,检测器信号响应与时间的关系 测量每个峰的峰面积,定量分析的基本公式： Mi i组分的量；Aii组分的峰面积；fi i组分的校正因子，与检测器的行为和被测组份的行为有关。 定量分析的依据是被测组分的量与响应信号成正比，但相同含量的物质
15、由于物理、化学性质的差别，即使在同一检测器上产生的信号也不同，直接用响应信号定量，必然导致较大误差。故引入校正因子。 校正因子是定量计算公式中的比例常数，其物理意义是单位面积所代表的被测组分的量。,1. 面积百分法 (Area Percent) 2. 外标法 (External Standard) 3. 内标法 (Internal Standard) 4. 归一化法 (Normalized Percent),色谱定量分析方法的种类,面积百分法,最简单的计算方法 样品中的所有成分对检测器的响应值相同 样品中的所有成分必须完全分离 表示样品中单一组份相对于其他组份的含量 面积 % = ( AI /
16、 A ) * 100 AI = 单一色谱峰的面积 A = 全部色谱峰的面积之和 不要求进样量准确 不适用于选择性检测器,归一化法(Normalized %),将样品中所有组份的含量之和定为100%。计算其中某一组份百分含量的定量方法： 其中：xi试样中组份I的百分含量 fi组份I的校正因子 Ai组份I的峰面积或峰高,归一化法示例,化合物 峰面积 校正因子 峰面积校正因子 百分比含量 C8 200 1.2 240 240/1708=14.1% C12 230 1.6 368 368/1708=21.5% C16 200 1.8 360 360/1708=21.1% C18 300 1.8 540 540/1708=31.6% C20 100 2.
