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1、临床微生物学检验与临床诊疗,-正确选择与留取送检标本,郑州大学第一附属医院检验科 郭小兵,现代感染的特点,新感染性疾病不断涌现；SARS、禽流感、猪流感 传统已被征服的疾病卷土重来：结核、性病 免疫力低下人群数量急剧上升：艾滋病、移植患者 人畜共患病逐步增多 细菌耐药状况日趋严重 实验室检测工作与临床要求相脱节 病原体分布与流行地域性差异逐步缩小,一、什么是临床微生物学检验,临床微生物学和微生物检验是为临床检验专业开设的必修课,是一门旨在培养学生掌握微生物学及其检验的基本理论、基本技术和基本技能。在感染性疾病中通过检验帮助临床诊断或确诊，判断疾病的转归和预后，密切结合临床提出及时有效的治疗方案
2、。在医院感染及传染病的流行情况时，防止微生物产生耐药性及预防起主要作用。,二、临床微生物检验常用的技术方法是什么,形态学检查 菌落特征 生化反应鉴定 血清学鉴定 分子生物学方法 质谱检测技术,细菌形态学检查,1、判断微生态平衡状况 2、为抗菌药物早期治疗提供依据 3、对于少数感染性疾病，明确诊断,菌落特征,1、为进一步生化反应鉴定提供依据。 2、为污染菌的区分提供依据。,生化反应鉴定,1、临床病原菌的鉴定。 2、临床病原的分型。 3、标准菌株的评价。 4、为血清学及分子生物学鉴定提供依据。,血清学鉴定,1、病原菌的鉴定 2、病原菌的分型与分群 3、明确感染阶段,分子生物学检测,1、病原菌的鉴定
3、 2、耐药机制的研究 3、细菌同源性分析 4、蛋白表达基因的克隆 5、基因定位研究,质谱检测技术,基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱仪(MALDI-TOF)指纹图谱法是一种微生物分类和鉴定的快速可靠的方法，通过MALDI-TOF质谱仪测得待测微生物的蛋白质指纹谱图，通过Biotyper软件对这些指纹谱图进行处理并和数据库中各种已知微生物的标准指纹图谱进行比对，从而完成对微生物的鉴定。与现有传统的微生物鉴定技术相比，具有操作简单、快速、通量高、灵敏度高、准确度好、试剂耗品非常经济等优势。,1.为临床感染性疾病的诊断提供病原学依据。 2.为临床感染性疾病的治疗用药提供 指导。 3.为医院感染提供病
4、原微生物及其耐药性动态信息。 4.探究细菌耐药机制及进行多重耐药菌的监测. 5.改进或更新临床微生物学检验的方法。,三、临床微生物学检验诊疗价值,四、如何有效实现检验的诊疗价值,1、搭建与临床交流的理想平台 2、及时/分批汇报检验结果 3、定期总结汇报细菌流行性变迁规律 4、定期总结汇报细菌耐药性变迁规律 5、加强质量控制，保证检验结果的准确性。,41%,55%,4%,五、如何正确留取检验标本,1.采集合适的微生物标本 2.在抗菌药物使用前采集标本 3.采样时严格执行无菌操作 4.采样后立即送检，甚至床旁接种 5.棉拭子标本宜用运送培养基 6.混有正常菌群污染标本，不可置肉汤培养 7.标本容器
5、须灭菌处理，但不得使用消毒剂 8.送检标本应注明来源和检验目的,标本采集原则,（一）采血指征 临床上疑为败血症、脓毒血症或其他血液感染的患者 1. 发热（38）或低温（36） 2. 寒战 3. 白细胞增多（10109/L，特别有“核左移”未成熟的或杆状核白细胞增多） 4. 粒细胞减少（成熟的多核白细胞1109/L） 5. 血小板减少 6皮肤粘膜出血 7昏迷，休克 8多器官衰竭 9. CRP、降钙素原升高,血培养标本采集,（二）消毒方法 1.皮肤消毒程序：严格执行三步法（防止皮肤寄生菌污染） （1）用75%酒精擦拭静脉穿刺部位待30s以上； （2）然后用1%-2%碘酊作用30秒或10%碘伏作用6
6、0秒，从穿刺点向外画圈消毒，至消毒区域直径达3cm以上； （3）最后用75%酒精脱碘，待酒精挥发干燥后采血。 新生儿及对碘过敏的患者，只能用75%酒精消毒60s，待穿刺部位酒精挥发干燥后穿刺采血。 2.培养瓶消毒程序： （1）用75%酒精消毒血培养瓶橡皮塞，作用60秒。 （2）用无菌纱布或无菌棉签清除橡皮塞表面剩余的酒精，然后注入血液。 血培养可接受的污染率通常是3%。研究表明，经过专门培训的熟练抽血者采集血培养的污染率为3%，而未经培训的住院医生和护士污染率则达11%。因此对临床护士就血培养标本采集进行专门的、严格的培训是非常必要的。,（三）血培养标本采集和运送 1.采集时间 要求：对怀疑菌
7、血症、真菌血症的患者，在考虑使用抗菌药物之前，应立即采集血培养标本。必须同时或间隔短时间内采集2套（每套包括1只普通血培养瓶及1只厌氧血培养瓶）以上血培养标本。 说明：实验数据表明细菌入血后约1小时，寒战和发烧开始出现2小时内，此时为采集血培养标本进行病原菌培养的最佳时机。,2.采集部位 要求：从两侧上肢静脉采血，“双瓶双侧”采血培养。至少做到“双侧双瓶”。必要时从下肢静脉采血做第三套血培养。 说明：不建议采集 （1）动脉血，因其诊断价值没有比静脉血更大； （2）静脉留置导管，因其常伴有高污染率。如果必须从留置导管内采血，也应同时从外周静脉采集另外一个血培养标本，以帮助阳性结果的判读。,所谓“
8、双瓶双侧”，是指从一个部位采血接种一套培养瓶，再从另一部位采血接种另一套培养瓶。（通常是双臂） 所谓“双侧双瓶”，是指从一个部位采血接种一个需氧瓶，再从另一部位采血接种另一个厌氧瓶。 一次静脉采血注入到多个培养瓶中应视为单个血培养。,3.采集次数 要求：对怀疑菌血症、真菌血症的成人患者，推荐同时采集23套（不同部位）血培养标本。（即双瓶双臂同时采集血培养标本。） 婴幼儿患者，推荐同时采集2次（不同部位）血培养标本。 说明：除特殊情况之外，在采取血培养后的2至5天内，无需重复采取血培养。因为抗菌治疗的2至5天内，血液中的细菌不会立即消失。研究证明，血培养只做1套的检出率为65%，做2套和3套的检
9、出率分别为80%和96%。单瓶的血培养检出率不高，而且结果很难做出临床解释。,4.采血量 要求： 成年患者推荐的采血量为每套不少于10ml，每瓶不少于5ml。 婴幼儿患者推荐的采血量为每瓶不少于2ml。 说明：血标本采集的量是影响检出率的最重要的因素。成人血培养采血量在230ml之间，病原菌检出率与采血量成正比例增长。每增加1ml的血液，病原菌的检出率增加3.2%。儿童患者因为血液中病原菌浓度较高，血培养量无需等同于成人。对血液病患者或者血容量相对较低的患者建议使用儿童瓶来减少血液的采集量增加病原菌的检出率。,6.血培养标本的运送 要求：（1）采集后的血培养瓶应在1小时之内送往实验室。 （2）
10、血培养瓶在接种前和接种后均不得冷藏和冷冻。 说明：血培养瓶冷藏或冷冻会将一些微生物杀灭，将装着液体的容器冰冻也会使容器破裂。,7.血培养的培养周期 要求：自动化血培养仪的标准血培养周期为5天。 说明：有研究表明，95%-97%的有临床价值的细菌会在3-4天内被自动血培养系统检出，目前仍推荐5天的培养周期。特殊情况可适当延长培养时间。如临床怀疑布鲁菌感染，可延长培养至28天等。,（一）采集指征 凡是发热、咳嗽和咳痰，痰呈脓性、粘稠或血性，并伴有胸痛、气急，肺部闻及湿罗音，外周白细胞总数及中性粒细胞比例明显增高，X线检查提示肺部有炎性浸润或胸腔积液，甚至出现感染性休克和呼吸衰竭等患者，应采集痰液或
11、下呼吸道标本。 对可疑烈性呼吸道传染病（如SARS、肺炭疽、肺鼠疫等）患者采集检验标本时必须注意生物安全防护。,下呼吸道标本（痰培养）,（二）采集方法 自然咳痰法 以晨痰为佳。用清水反复漱口，用力咳出呼吸道深部的痰，痰液直接吐入无菌容器中，尽快送检。否则有的细菌（如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌）在外界可能死亡。不能及时送检的标本，室温保存2h。要求采到肺深部的痰液，不要唾液。 小儿取痰法 用弯压舌板向后压舌，用棉拭子深入咽部，小儿经压舌刺激咳嗽时，可喷出肺部和气管分泌物，粘在棉拭子上送检。幼儿还可用手指轻叩胸骨柄上方，以诱发咳痰。,（三）注意事项 1. 痰标本不能及时送检者，可暂存4冰箱。室温下耽
12、搁数小时，定植于口咽部的非致病菌过度生长而肺炎链球菌、葡萄球菌和流感嗜血杆菌检出率则明显降低。 2. 在临床上咳痰仍是诊断肺部感染最常用的标本，但咳痰也最易被口咽部正常菌群污染。 3.由于口腔和咽部存在大量的革兰阳性和革兰阴性厌氧细菌，而且缺乏可靠的方法区分它们究竟是致病菌还是定植菌，因此不主张对咳痰标本进行厌氧菌培养。 4. 约有1/41/2肺部感染患者可能发生菌血症，应同时做血培养。,（一）尿培养标本送检指征 1. 有典型的尿路感染症状； 2. 有肉眼脓尿或血尿； 3. 尿常规检查白细胞或亚硝酸盐阳性； 4. 有不明原因的发热，无其他局部症状； 5. 留置导尿管的患者出现发热； 6. 膀胱
13、排空功能受损； 7. 泌尿系统疾病手术前； 8. 有尿路感染症状者，前次培养结果阴性或抗菌治疗48h后仍持续发热。 9. 抗生素停药后，感染症状再次出现。,尿培养标本采集,（二）尿培养标本采集方法 标本采集应在使用抗生素之前，避免消毒剂污染标本。 1清洁中段尿 留取清晨清洁中段尿标本，先用肥皂水仔细清洗会阴部，再用清水冲洗尿道口周围；将前段尿排去，留取中段尿10ml左右于无菌容器内，立即加盖送检，2h内接种。该方法简单、易行，是最常用的尿标本收集方法，但是容易受到会阴部细菌污染。 2耻骨上膀胱穿刺 使用无菌注射器直接从耻骨上经皮肤消毒穿入膀胱吸取尿液，是评估膀胱内细菌感染的“金标准”方法，主要
14、用于厌氧菌培养或留取标本困难的婴儿尿标本的采集。,（三）注意事项 1. 合理评价才能判断培养的细菌是否与尿路感染有关。尿标本菌落计数中革兰阴性杆菌数105CFU/ml 或革兰阳性球菌数104CFU/ml时有临床诊断意义。 2.尿标本采集后应立即送检，以免污染，尿液中不得加防腐剂和消毒剂。 3.长期留置导尿管患者常规尿培养没有临床意义，大量病原菌常可在这类患者中检出，导尿管留置时间延长易导致与引起患者尿道感染不一致的微生物定植生长。,（四）尿中细菌数量影响因素,使用抗生素治疗，细菌生长受到抑制； 尿液稀释，尿比重1.003，营养成分减少，细菌生长迟缓； 尿PH5.0或8.5，细菌生长受阻； 尿频
15、时，膀胱内细菌停留时间短，菌落数减少； 尿道口消毒液混入标本中，影响细菌繁殖，菌落数减少； 不同种类的细菌生长速度不同、营养要求不同，菌落计数有所 不同。,六、标本的运送原则,所有的标本都必须立即送往实验室，最好在2h内,保存时间不应超过24h. 最佳的临床标本送检首先取决于所获取标本的量.量少的标本应在采集后15-30min内送检. 对环境敏感的微生物如志贺菌、奈瑟氏菌和流感嗜血杆菌（对低温敏感）应立即处理，禁止冷藏脊髓液和生殖道、眼部、内耳道标本。,七、实验室如何把握标本质量,无标签 不检测，并与送检的医生和护士联系。 送检延误 不接收，提醒送检者，要求重新采集。 送检容器不当或渗漏 不接
16、收，告知送检者，要求重新采集。 标本不符合要求 不接收，联系送检者，指出不符合要求之处，要求重新采集符合试验要求的标本. 同一天内收到同一检测目的的相同标本（血液标本除外）不检测，与送检者联系并说明标本重复不予处理，并在报告单上注明,合格标本的判断标准 外观：观察颜色、粘度、有无血丝或脓。若标本为水状且很明显是唾液，则应拒收。 为了判定是否来自下呼吸道的痰，需检查是否为合格的痰标本。白细胞25个/低倍镜视野、鳞状上皮细胞10个/低倍镜视野为合格标本。采集合格标本对细菌的诊断极为重要。,合格痰液标本,不合格痰液标本,八、常用检测项目及临床意义,(一)标本类型 血、尿、便、痰液、胸腹水、分泌物、生殖道标本、无菌体液等 （二）耐药基因检测 1、耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）的检测 2、超广谱-内酰胺酶（ESBLS）的检测 3、HLAR（高水平耐氨基糖苷类）肠球菌的检测 4、AmpC酶的检测 5、耐青霉素的肺炎链球菌（PREP）,九、如何有效利用与评价临床微生物检验结果,1.及时查阅临床微生物检测结果；
